核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

關(guān)于核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一.核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用下形成水解產(chǎn)物。第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月酸易水解N-糖苷鍵，嘌呤堿基比嘧啶堿基易被酸水解，脫氧核糖比核糖的糖苷鍵易水解，DNA的嘌呤堿在pH2以下即脫落而成嘌呤酸。堿易水解磷酸酯鍵，RNA在0.3N堿中即被水解，DNA對堿相對穩(wěn)定。第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶水解生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。核酸酶的分類按底物專一性分：以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。按作用方式分：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。按作用鍵分：水解3-磷酸酯鍵和5-磷酸酯鍵的核酸酶，產(chǎn)物分別是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月核糖核酸酶舉例牛胰核糖核酸酶（RNaseI）,內(nèi)切酶，水解嘧啶3'-磷酸和其他核苷酸5'-OH形成的酯鍵，產(chǎn)生3'-磷酸核苷。核糖核酸酶T1，內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)于米曲霉，水解3‘-鳥苷酸與其他核酸5’-OH形成的酯鍵，產(chǎn)物為3‘-鳥苷酸為末端的寡核苷酸。第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月脫氧核糖核酸酶舉例1.牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseI），內(nèi)切酶，水解DNA3‘-磷酸酯鍵，產(chǎn)生5’-磷酸的寡核苷酸，平均長度為4個核苷酸。2.牛脾脫氧核糖核酸酶（DNaseII），內(nèi)切酶，水解DNA5‘-磷酸酯鍵，產(chǎn)生3’-磷酸的寡核苷酸，平均長度為6個。3.限制性內(nèi)切酶，可識別特異的堿基序列并水解斷開，產(chǎn)物帶5‘-磷酸基，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種，是基因工程的重要工具酶。N-糖苷酶水解糖苷鍵，產(chǎn)物為含氮堿基和無堿基末湍的寡核苷酸第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二.核酸的酸堿性質(zhì)兩性解離：DNA無，只有酸解，堿基被屏蔽（在分子內(nèi)部形成了氫鍵）。RNA有兩性解離，有pI。核酸的堿基、核苷、核苷酸均能發(fā)生解離，因此核酸是兩性電解質(zhì)堿基的解離：嘧啶和嘌呤環(huán)上的N及各取代基具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力。核苷的解離：堿基和核糖具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力核酸的解離：磷酸基具有較強的酸性，核酸的兩性解離主要決定于磷酸基和含氮堿基。

第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

三.核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組分定性和定量測定的依據(jù)。以A260/A280進(jìn)行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外線下發(fā)出熒光。用A260/A280還可用來表示核酸的純度：大于1.8，DNA很純；大于2，RNA很純。

第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品中如含有雜蛋白及苯酚，比值明顯降低。對于純的樣品，只要讀出260nm的A值即可算出含量。通常以A值為1相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA，或40μg/ml單鏈DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸計算。第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月有時核酸的紫外吸收以摩爾磷的吸光度來表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。先測定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)ε(P)。

ε(P)=A/cLA為吸收值，c為每升溶液中磷的摩爾數(shù)，L為比色杯內(nèi)徑。

c=每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（30.98）

ε(P)=30.98A/WL一般天然DNA的ε(P)為6600，RNA為7700-7800。核酸的ε(P)值較所含核苷酸單體的ε(P)要低40%-45%。單鏈多核苷酸的ε(P)值比雙螺旋結(jié)構(gòu)多核苷酸的ε(P)要高，所以核酸發(fā)生變性時，ε(P)升高約25%，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）。復(fù)性后ε(P)又降低，這現(xiàn)象稱減色效應(yīng)(hypochromiceffect)。第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月四.核酸的變性，復(fù)性及雜交(一)變性穩(wěn)定核酸雙螺旋的次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的一級結(jié)構(gòu)(核苷酸順序)保持不變。變性表征

生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素

pH（>11.3或<5.0）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）低離子強度加熱第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

熱變性與TmDNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。（或者把加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔解溫度）。一般DNA的Tm值在82-95C之間。第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的Tm值大小與下列因素有關(guān)：（1）DNA的均一性。均質(zhì)DNA，如一些病毒的DNA，人工合成的polyd(A-T),polyd(G-C)熔解過程發(fā)生在一個較小的范圍內(nèi)。異質(zhì)DNA熔解的過程發(fā)生在一個較寬的范圍內(nèi)。所以Tm值可作為衡量DNA樣品均一性的標(biāo)準(zhǔn)。（2）分子中G和C的含量。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)Χ2.44（3）介質(zhì)的離子強度。一般離子強度較低的介質(zhì)中，DNA的熔解溫度較低，而且溶解溫度的范圍較寬。第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽濃度對DNA變性的影響第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA的變性：RNA也具有螺旋線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變。但這種較變不如DNA明顯。變性曲線不陡，Tm值較低。tRNA具有較多的雙螺旋區(qū)，所以具有較高的Tm值，變性曲線也較陡。第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）復(fù)性變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火”。退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/溶液離子強度第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月將熱變性的DNA驟然冷卻時，DNA不可能復(fù)性DNA的片段越大，復(fù)性越慢DNA的濃度越大，復(fù)性越快在一定條件下，復(fù)性反應(yīng)的速度用Cot1/2來衡量，Co為變性DNA復(fù)性時的初始濃度，t為時間，Cot?表示復(fù)性一半時的DNA濃度。兩種濃度相同但來源不同的DNA，復(fù)性時間的長短與基因組的大小有關(guān)有很多重復(fù)序列的DNA復(fù)性也快第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

（三）核酸的雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southern雜交（Southernbolting）Northern雜交（Northernbolting）Western雜交（Westernbolting）第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的雜交第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月<1>核酸分子雜交的意義：

發(fā)現(xiàn)原核生物的基因是連續(xù)基因，而真核生物的基因是斷裂基因。

連續(xù)基因：基因中的bp序列能夠連續(xù)的在成熟的蛋白質(zhì)中找到其相應(yīng)的AA，電鏡顯示這種基因能夠和它的成熟mRNA形成平滑的雜交分子。

斷裂基因：基因中的bp序列能夠斷續(xù)的在成熟的蛋白質(zhì)中找到其相應(yīng)的AA，電鏡顯示這種基因和它的成熟mRNA只能形成帶泡的雜交分子。發(fā)現(xiàn)癌基因的普遍性：腫瘤病毒的RNA能夠與人類正常的DNA分子形成帶泡的雜交分子。

第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月<2>核酸分子雜交的技術(shù)

SouthernBlotting（南印跡）：用于釣基因，即用已知的DNA單鏈或RNA，釣取未知DNA分子中的基因，方法如下：

未知的DNA--DNA限制性內(nèi)切酶DNA片段瓊脂糖電泳分離堿液變性影印在硝酸纖維薄膜上與放射性標(biāo)記的已知DNA單鏈或RNA雜交放射自顯影NorthernBlotting（北印跡）：用已知的DNA釣mRNA，方法如下：

眾多未知的RNA電泳分離變性影印用標(biāo)記的已知DNA單鏈雜交放射自顯影WesternBlotting（西印跡）：蛋白質(zhì)與抗體的雜交，跟核酸無關(guān)。第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

Southern

DNA印跡雜交

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同位素標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)（a）（b）（c）（d）（e）基因