DNA重組技術(shù)的基本工具

基因工程專題1目前一頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)煙草據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬人中國衛(wèi)生部通報：2004年７月，狂犬病列法定報告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%

能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉(zhuǎn)基因目前二頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。為什么基因可以在其他種類的生物中表達(dá)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用目前三頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論目前四頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律目前五頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。目前六頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體。目前七頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。目前八頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制目前九頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制目前十頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。目前十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)目前十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明目前十三頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，在DNA分子水平上進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。目前十四頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的新生物類型和產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)目前十五頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)專題一基因工程“分子手術(shù)刀”──限制酶

“分子縫合針”──DNA連接酶

“分子運(yùn)輸車”

──基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

§1DNA重組技術(shù)的基本工具目前十六頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)提示：原核生物在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生的保護(hù)機(jī)制，可防止外源DNA的入侵而滅絕。1.限制性內(nèi)切酶從哪里尋找？Why？思考2.為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？不具備這種限制酶的識別切割序列通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶目前十七頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)：從特定部位的兩

個核苷酸之間切開。

（磷酸二酯鍵）能識別特定核苷

酸序列；T1234512345A目前十八頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)

EcoRⅠ黏性末端黏性末端目前十九頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)SmaⅠ平末端平末端目前二十頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)限制酶所識別的序列的特點(diǎn)：

中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。P7思1EcoRⅠSmaⅠ目前二十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是原核生物4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶黏性末端平末端目前二十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)1、分類E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶2、作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開了的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。二、“分子縫合針”——DNA連接酶目前二十三頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵目前二十四頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶目前二十五頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGUUGUUADNA聚合酶DNA連接酶尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?目前二十六頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)能將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板查詢：P7思4目前二十七頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：⑴有1~多個限制酶切點(diǎn)⑵對受體細(xì)胞無害⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運(yùn)載體：⑴質(zhì)粒⑵病毒包括植物病毒、動物病毒和細(xì)菌病毒（噬菌體）⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，如果沒有切割位點(diǎn)將會怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個限制酶切點(diǎn)，你會用它來做分子運(yùn)輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

（最常用）目前二十八頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。目前二十九頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別P7思3實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。目前三十頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么？請?jiān)O(shè)計實(shí)驗(yàn)、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。對照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素試一試目前三十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)對照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3結(jié)論預(yù)期一＋＋＋＋預(yù)期二＋＋－－預(yù)期三＋－＋－預(yù)期四＋－－－對照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因目前三十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十二點(diǎn)模擬制作——課后完成用剪刀在特定部位對棉花DNA進(jìn)行