DNA多態(tài)性及其分析2

DNA多態(tài)性及其分析技術(shù)

免疫與分子生物學(xué)技術(shù)研究室

王青廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所目前一頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)第一節(jié)多態(tài)性概述

一．定義自然界的生物有千百萬種，每一種生物的個(gè)體之間存在著許多的差異。一種生物群體內(nèi)，某一性狀方面也存在著不同的個(gè)體變異。不同種的生物以及同一種生物的不同個(gè)體之間都存在著許多差異，稱為生物的多態(tài)現(xiàn)象，即生物的多態(tài)性。（polymorphism）目前二頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)環(huán)境因素遺傳因素營養(yǎng)、氣候、疾病等遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）不同個(gè)體之間，其生化特征、抗原特性都存在著由遺傳造成的變異，形成一系列的多態(tài)性，由相應(yīng)的基因控制。

生物進(jìn)化概念目前三頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)二．標(biāo)準(zhǔn)

基因座位：基因在染色體上的位置等位基因（alleles)：二倍體個(gè)體中，位于一對同源染色體相等位置上（相同座位上），控制著同一性狀的基因，具有兩種或兩種以上的形式。純合子：二倍體中，在一定的座位上帶有兩個(gè)相同的等位基因的個(gè)體。雜合子：在一定的座位上帶有兩個(gè)不同的等位基因的個(gè)體。（一般是針對所研究的一對或幾對基因而言。）目前四頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)多態(tài)性：發(fā)生遺傳分離的基因座位（locus）具有兩個(gè)以上等位基因時(shí)，其最常見的等位基因的頻率不超過0.95或0.99時(shí)，這個(gè)基因座位就被認(rèn)為具有多態(tài)性。

個(gè)人——一對等位基因（如ε1/ε2

，或ε2/ε3）人群——復(fù)等位基因（如ε1

、ε2

、ε3、

ε4）,如

ABO血型基因、人類白細(xì)胞抗原基因二態(tài)性（dimorphism）：在某些時(shí)候，一個(gè)基因位點(diǎn)上只由一個(gè)基因占據(jù)，但有時(shí)這個(gè)位置上缺乏這一基因，這時(shí)就會(huì)出現(xiàn)“有”和“無”兩種情況，被稱為二態(tài)性。

目前五頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)遺傳多態(tài)性廣泛存在于生物界。果蠅有著大量的蛋白質(zhì)水平上的遺傳變異哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白有高度的遺傳多態(tài)性即使是純系的小鼠，其免疫球蛋白IgG2a重鏈編碼區(qū)1108個(gè)堿基中就有110個(gè)（10%）的堿基組成互不相同，其中有18個(gè)堿基替換是同義的，其余的變異則編碼不同的氨基酸。

目前六頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)三．分類

遺傳表型的多態(tài)性

DNA的多態(tài)性

由遺傳控制表現(xiàn)出來的性狀就是遺傳表型

紅細(xì)胞表面的抗原多態(tài)性系統(tǒng)：有ABO、Rh等20余種

人類白細(xì)胞抗原（HLA）系統(tǒng)

人類的免疫球蛋白

性狀：生物體表現(xiàn)出的形態(tài)特征（如花色）和生理生化特征（如抗病性、合成某種物質(zhì)的能力)。表型：個(gè)體所具有的全部或部分性狀。是基因型與環(huán)境作用的結(jié)果。目前七頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)人30億堿基（bp)基因及相關(guān)序列20%~30%

編碼序列＜10%——檢測表型多態(tài)性非基因序列70~80%中度或高度重復(fù)序列20-30%單一或低拷貝序列70-80%在所有生物體的基因組中都存在著天然的DNA序列變異由于基因組的大多數(shù)序列不編碼蛋白質(zhì)，因此可容納大量的序列變異估計(jì)在人群個(gè)體之間每200~400個(gè)核苷酸就能檢測到一個(gè)核苷酸的變異。某一變異的群體頻率達(dá)到或超過1%即被認(rèn)為屬DNA多態(tài)性。目前八頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)遺傳表型的多態(tài)性只反映出編碼基因的部分變異編碼序列只占人基因組總DNA的10～15%，甚至可能不到總DNA序列的5%。DNA序列中的同義突變不會(huì)引起表型的改變基因的表達(dá)也會(huì)有變異：

——環(huán)境作用

——從基因到基因產(chǎn)物會(huì)受到許多因素的影響，而改變最終產(chǎn)物。分析DNA的多態(tài)性才能真正深刻地揭示生物的多態(tài)性目前九頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)第二節(jié)DNA多態(tài)性的分類DNA是遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)，因而是反映個(gè)體間差異的最本質(zhì)東西

進(jìn)化、發(fā)育過程中的遺傳變異

:DNA堿基序列的點(diǎn)突變移碼突變DNA片段的插入或缺失生殖細(xì)胞成熟過程中染色體DNA的交換重組轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用等DNA的序列組成完全是個(gè)體特異的目前十頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)一．基因多態(tài)性

二．重復(fù)序列多態(tài)性

三．性染色體多態(tài)性

四．線粒體的DNA多態(tài)性

目前十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)一．基因多態(tài)性

基因的多態(tài)性遺傳表型的多態(tài)性

在生物群體中，對于某一基因座位來說，屬于這一位點(diǎn)的等位基因越多，這一座位的基因多態(tài)性就越復(fù)雜。

HLA白細(xì)胞抗原系統(tǒng)：僅HLA-DR抗原的編碼位點(diǎn)就有HLA-DRA，-DRB1，B2，B3，B4，B5等10個(gè)座位，超過200個(gè)等位基因。例如分析限制性內(nèi)切酶消化等位基因特異性的探針目前十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)二．重復(fù)序列多態(tài)性

串聯(lián)重復(fù)序列

——相同的核心序列（coresequence）按首尾相接的方式排列。在重復(fù)序列兩翼，DNA片段的堿基組成相同限制性內(nèi)切酶不同長度的DNA片段GATCGATCGATCGATC12BAssDNA探針大片段小片段目前十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)（1）不同個(gè)體——核心序列重復(fù)的次數(shù)不同（2）不同的串聯(lián)重復(fù)序列，其核心序列的組成會(huì)不同（3）在核心序列之間，有時(shí)不同的個(gè)體間會(huì)存在有無插入小段的DNA序列或插入的片段長短不同之差DNA指紋由于不同的個(gè)體其核心序列重復(fù)的次數(shù)不同，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切時(shí)，形成不同長度的DNA片段，這類多態(tài)性被稱為VNTR（variablenumbersoftandemrepeats，VNTR），可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性。兩個(gè)無關(guān)個(gè)體之間的VNTR的變異能達(dá)到完全個(gè)體特異的程度目前十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）:串聯(lián)重復(fù)序列中有一類較短的，稱為～。許多基因的內(nèi)含子部分含有此類序列。

特點(diǎn)：G＋C含量高插入或缺失此類序列的事件發(fā)生頻繁，有時(shí)還會(huì)發(fā)生跳躍復(fù)制的現(xiàn)象。

1985年，Jeffreys等首先用人肌紅蛋白基因內(nèi)含子中一段高度重復(fù)的小衛(wèi)星DNA為探針，獲得了具有個(gè)體特異性的DNA指紋圖譜。應(yīng)用目前十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)中度重復(fù)的散在重復(fù)序列：散在重復(fù)序列的某些重復(fù)單位可能是轉(zhuǎn)座子（transposon）。

——一種能夠反復(fù)插入到基因組中許多位點(diǎn)的特殊DNA片段。它可以從基因組上一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)，從一個(gè)復(fù)制子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)復(fù)制子。

目前十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)三．性染色體多態(tài)性

X染色體——著絲粒周圍也有一類重復(fù)序列形成X染色體的VNTR類多態(tài)性。Y染色體——在哺乳動(dòng)物的染色體中Y染色體似乎是最少保守性的。用不同的限制性內(nèi)切酶和DNA探針，可以揭示出Y染色體特異性片段的多態(tài)性。目前十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)四．線粒體的DNA多態(tài)性

線粒體DNA屬于核外基因，表現(xiàn)為非孟德爾規(guī)律遺傳。人mtDNAD環(huán)一端347bp的序列分析資料證明，兩個(gè)無關(guān)個(gè)體間，這一段mtDNA序列完全相同的可能性只有0.27%（即1/370）。因此，mtDNA序列組成的多態(tài)性同樣可以用作個(gè)體識別。目前十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)SNP單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。

目前十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)第三節(jié)

DNA多態(tài)性分析技術(shù)

1979年，Jeffreys等人首先用限制性內(nèi)切酶和-珠蛋白基因探針直接觀察到DNA的多態(tài)性。即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。1985年，Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，簡稱PCR）技術(shù)，對DNA多態(tài)性的分析。目前二十頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)一．RFLP分析技術(shù)

（一）基本原理

限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)，簡稱RFLP技術(shù)（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）1.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能夠識別DNA雙鏈上特異的堿基序列并能將之切斷。不同的限制性內(nèi)切酶有各自特異的識別序列，一般為4~8個(gè)堿基對。2.DNA區(qū)段堿基組成不同。用一種限制性內(nèi)切酶消化，就會(huì)產(chǎn)生不同長度的酶切片段。目前二十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)A含1,2兩個(gè)酶切位點(diǎn)的DNA片段B點(diǎn)突變使酶切位點(diǎn)1缺失C點(diǎn)突變產(chǎn)生酶切位點(diǎn)3D序列重排使酶切位點(diǎn)2移位E含有酶切位點(diǎn)2的片段缺失F序列插入，如存在數(shù)量不同的串聯(lián)重復(fù)序列，即VNTR12122312112目前二十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)采用合適的限制性內(nèi)切酶切出一系列長度的DNA片段根據(jù)片段是否長度一致來推測其DNA序列是否相同用標(biāo)記好的相應(yīng)的DNA探針與這些片段進(jìn)行雜交圖譜反映出基因組DNA堿基序列組成是否存在差異。RFLP——通過核酸的限制性酶切片段長度多態(tài)性來揭示DNA堿基序列組成的不同，因而稱為限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)。目前二十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)（二）RFLP技術(shù)的基本步驟抽提DNA（從血或組織）培養(yǎng)細(xì)菌人工合成探針

限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒純化純化探針瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)記探針（同位素或非同位素）Southern轉(zhuǎn)移、固定

預(yù)雜交

雜交

洗膜

放射自顯影或顯色后分析結(jié)果RFLP技術(shù)的基本步驟靶DNA的準(zhǔn)備

核酸探針的標(biāo)記雜交顯示目前二十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)正常人染色體DNA含有4個(gè)完全一樣的α-珠蛋白基因，而α-地中海貧血患者則缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)α-珠蛋白基因用α-珠蛋白基因探針對患者或產(chǎn)婦進(jìn)行RFLP分析：當(dāng)用EcoRI和HpaI酶切后，正常人標(biāo)本出現(xiàn)4.8、4.1kb兩條雜交帶；患者僅出現(xiàn)5.6kb雜交帶用EcoRI和HindIII酶切后，正常出現(xiàn)2.1、3.1、16kb雜交帶；患者出現(xiàn)2.1、16kb雜交帶。遺傳性疾病的基因診斷和產(chǎn)前診斷α-地中海貧血例如5.6kb4.8kb4.1kb16kb3.1kb2.1kb目前二十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)（三）RFLP技術(shù)可選擇的幾個(gè)因素

1．限制性內(nèi)切酶是影響RFLP圖譜的一個(gè)重要因素。已分離500種，常見的100多種

①識別序列：多數(shù)為4至6個(gè)堿基識別4個(gè)堿基對的限制性內(nèi)切酶能把人基因組DNA切出較短的小片段，而識別6個(gè)或更多堿基對的限制性內(nèi)切酶，酶解出的較長的DNA片段。

如Sao3AI識別GATC如EcoRI位點(diǎn)為GAATTC

②反應(yīng)條件：包括反應(yīng)液的pH，內(nèi)含乙醇、甘油的量，反應(yīng)溫度和時(shí)間等，以及DNA的質(zhì)量和濃度。星號*活性，即非特異性酶解活性

目前二十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)

限制性核酸內(nèi)切酶——能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。

識別位點(diǎn)：回文序列

反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，即旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)一般為4~8個(gè)堿基對例如EcoRI的識別序列：

5＇-GAATTC-3＇

3＇-CTTAAG-5’BamHI識別序列：5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’目前二十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)2．核酸探針

由于人基因組DNA鏈很長，用某一限制性內(nèi)切酶消化后，酶解出來的各種不同長度的片段往往數(shù)量巨大，電泳后幾乎是連續(xù)排列的，無法進(jìn)行分析比較。

選取某種特定的DNA片段作為探針，標(biāo)上一定的標(biāo)記物（如同位素、生物素等），利用堿基互補(bǔ)的兩條DNA單鏈能結(jié)合（雜交）的原理，就可以在連續(xù)排列的一系列DNA片段中顯示出與探針有同源序列的某些DNA片段。不同的DNA探針會(huì)顯示出不同類型的RFLP圖譜。

目前二十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)探針分類：（1）基因探針大多數(shù)取自人基因組中某一基因的一個(gè)片段。人類基因組中，最早確定有多態(tài)性的是α珠蛋白基因位點(diǎn)和胰島素基因位點(diǎn)。cDNA探針——用mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，探測的是此基因中的外顯子部分。人工合成——可以隨研究者的設(shè)計(jì)而合成

目前二十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)（2）隨機(jī)探針

隨意挑選出的DNA片段

要能夠揭示出人基因組DNA的酶切片段長度多態(tài)性就行。特點(diǎn)：能比較快地了解該染色體的某些限制性片段多態(tài)性與研究對象（如某種疾病基因）的相關(guān)性。片段較大的隨機(jī)DNA探針比片段較小的更易檢測出RFLP來

目前三十頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)（3）重復(fù)序列探針

如α小衛(wèi)星DNA，其重復(fù)單位群集在基因組的某一特定區(qū)域。重復(fù)序列探針能檢測出基因組中多處具有此類重復(fù)序列的DNA片段。特點(diǎn)：能一次性檢測出多個(gè)位點(diǎn)的DNA片段多態(tài)性

目前三十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)Jeffreys等從第22號染色體上肌紅蛋白基因的內(nèi)含子中分離出來的高度可變的“小衛(wèi)星DNA”探針。

并證明兩個(gè)無關(guān)個(gè)體之間，這類多態(tài)性相同的機(jī)會(huì)極微（只有3×10－11），因而他稱這種RFLP圖譜為DNA“指紋”。應(yīng)用：親子鑒定法醫(yī)學(xué)個(gè)人認(rèn)定人類學(xué)研究遺傳病相關(guān)性分析目前三十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)

將總DNA用限制性內(nèi)切酶完全酶解以后，用放射性的探針進(jìn)行Southern印跡，每個(gè)人的DNA所產(chǎn)生的陽性雜交條帶都是特異性的，而且子女的陽性雜交帶中，有一半與父親的DNA陽性雜交帶相同，另一半是與母親的陽性雜交帶相同。用這種重復(fù)序列作為探針，對不同的人的DNA進(jìn)行指紋分析，產(chǎn)生完全相同的圖譜的機(jī)會(huì)小于60億分之一。可用于法醫(yī)鑒定、血緣關(guān)系的識別等。這一實(shí)驗(yàn)方法所提供的證據(jù)已于1988年得到英國法庭的認(rèn)可。目前三十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)人的DNA指紋分析示意圖子女DNA指紋圖中分別與其父、母的DNA指紋中相應(yīng)的分子雜交條帶相對應(yīng)目前三十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)（4）人工合成的寡核苷酸探針

1986年，Ali等以AluI和MboI酶消化人基因組DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷酸作探針進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其RFLP圖譜同樣具有個(gè)體特異性。這類探針檢測的對象主要是人基因組中的散在重復(fù)序列DNA。提示：根據(jù)自己研究的主要對象來設(shè)計(jì)各種各樣的探針（包括各種長度的以及各種堿基組成的）。人基因組DNA用合適的探針和限制性內(nèi)切酶酶切，一般都能揭示出人基因組中的RFLP。

目前三十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)在其它動(dòng)物的研究中：在動(dòng)物基因組中任選一段DNA片段作為探針再用此探針去檢查該動(dòng)物基因組的限制性酶切片段長度多態(tài)性。許多昆蟲類動(dòng)物可以用此方法進(jìn)行種、群分類。

目前三十六頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)1.檢測對象的DNA分子必須保持大分子。在抽提DNA過程中避免人為地將DNA分子機(jī)械性切割成小片段的DNA，否則最終的結(jié)果可能是一種假象。2.在用限制性內(nèi)切酶消化大分子DNA時(shí)，要使DNA被完全消化，否則也會(huì)出假結(jié)果。3.被消化的DNA濃度不能太高。4.電泳時(shí)要低電壓電泳。5.雜交前探針必須充分變性。6.要根據(jù)探針標(biāo)記的情況以及探針與靶DNA間序列互補(bǔ)的程度和GC含量來掌握洗膜的條件。7.作放射自顯影時(shí)，要根據(jù)探針標(biāo)記的放射比活性以及靶DNA的量等因素決定曝光的時(shí)間。

注意目前三十七頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)二．PCR分析DNA多態(tài)性

PCR（polymerasechainreaction）是一種在試管里擴(kuò)增特定的DNA片段的技術(shù)。設(shè)計(jì)引物：按照所研究的DNA（稱靶DNA）片段的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出與此DNA片段二翼的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸。變性：通過加熱（92~95℃）使靶DNA（又稱DNA模板）變性成為兩條單鏈DNA。退火（復(fù)性）：然后將溫度降至37℃~55℃，引物就會(huì)結(jié)合在模板DNA中與其堿基互補(bǔ)的序列上。延伸：將溫度升至70℃~72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，引物就會(huì)按5’→3’的方向，嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則，逐步延伸。

目前三十八頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)1．分析基因多態(tài)性

方法：特異性引物

擴(kuò)增特異性基因片段與此位點(diǎn)上所有的等位基因探針都雜交確定屬哪個(gè)等位基因

等位基因間的差異一般表現(xiàn)為幾個(gè)堿基或十幾個(gè)堿基組成的不同，因而區(qū)分這些不同的等位基因多采用等位基因特異性探針（allele-specificoligonucleotideprobe，ASO）與擴(kuò)增出來的DNA片段進(jìn)行雜交，根據(jù)能與哪一個(gè)探針進(jìn)行雜交來確定該DNA片段屬哪一個(gè)等位基因。人類HLA系統(tǒng)——已知有30多個(gè)位點(diǎn)，超過500個(gè)等位基因。其中的某一位點(diǎn)，往往有多個(gè)、甚至幾十個(gè)等位基因。

難以實(shí)現(xiàn)多態(tài)性的分析目前三十九頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)2．分析擴(kuò)增DNA的限制性片段長度多態(tài)性

擴(kuò)增DNA的限制性酶切片段長度多態(tài)性（Amplificationrestrictionfragmentlengthpolymorphism,簡稱Am-RFLP）技術(shù)

概括為：PCR+酶切應(yīng)用舉例：串聯(lián)重復(fù)序列的核心很短（只有4～5bp），重復(fù)次數(shù)的差異又不大時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長短較為接近，用普通瓊脂糖凝膠電泳難以區(qū)分開來。這時(shí)可以根據(jù)擴(kuò)增片段堿基組成的規(guī)律，選擇某種限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增片段酶切。這種酶切片段的長度差異往往較大，可以用瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分出不同的等位基因。

目前四十頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)載脂蛋白E（apoE）基因多態(tài)性與心腦血管疾病和老年癡呆密切相關(guān)，確定個(gè)體apoE基因?qū)εR床應(yīng)用研究及診斷治療十分必要。ApoE三種常見的等位基因是ε2、ε3、ε4，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，以CfoI內(nèi)切酶消化，結(jié)果：一般在擴(kuò)增的片段較長時(shí)常用此方法。較為簡便，無需測序和雜交，適于大范圍人口檢測和臨床實(shí)驗(yàn)室開展。也稱為PCR-RFLP。目前四十一頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)3.隨機(jī)引物PCR法分析DNA的多態(tài)性

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)1990年，Willian和Weles等創(chuàng)建方法：由于DNA組成完全是個(gè)體特異的，隨意設(shè)計(jì)單個(gè)很短的引物去擴(kuò)增不同人的DNA模板結(jié)果：擴(kuò)增出來的DNA片段的數(shù)量和大小會(huì)因人而異，通過電泳可以把不同個(gè)體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開來。目前四十二頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)引物：長10個(gè)堿基左右，G和C的含量在50~80%之間，不含回文結(jié)構(gòu)，而且單條引物即可。特點(diǎn)：可以在完全不知道特定DNA順序的情況下分析其多態(tài)性，方法簡便，能檢出的遺傳信息量大。目前四十三頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)西紅花及其偽冒品的RAPD指紋圖1.Marker2.西班牙紅花3.印度紅花4.川紅花5.蓮須6.玉米須7.黃花菜不同來源同種藥材的RAPD指紋圖1.新鮮西洋參2.干品西洋參3.西洋參組織培養(yǎng)物4.新鮮人參5.生曬參1（干品）6.生曬參2（干品）

目前四十四頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用：不僅可用于個(gè)人識別、疾病的相關(guān)性分析，還可用于其它各種遺傳學(xué)研究（中藥鑒定）。優(yōu)點(diǎn)：①可以用一系列的通用引物分析不同種類的生物。②可用于制備探針和分析未知的DNA順序。③由于每一個(gè)RAPD標(biāo)記對應(yīng)一種DNA順序，可大大簡化多種相關(guān)研究。（通過隨意引物擴(kuò)增的DNA順序，稱為RAPD標(biāo)記）

目前四十五頁\總數(shù)五十二頁\編于十二點(diǎn)4.簡單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simplesequencerepeats,ISSR）簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeats，SSR）又叫微衛(wèi)星序列（microsatellite）：主要是以l~4個(gè)核苷酸為基本單位的串聯(lián)重復(fù)序列其長度大多在100~20