植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)

植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)..植物生理是實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科，學(xué)生必需通過實(shí)驗(yàn)、實(shí)習(xí)才能加深對(duì)理論課的理解，并為后續(xù)專業(yè)課的學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)，同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)、實(shí)踐可以提高學(xué)員觀察問題和解決問題的能力，提高學(xué)員的動(dòng)手能力及獨(dú)立思考、分析問題的能力；在實(shí)驗(yàn)課中要通過實(shí)例論述論證，讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)的重要性，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)課的興趣；系統(tǒng)介紹植物生理的一般研究方法和基本技術(shù)；一、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本要求

重視培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)際操作技能，不片面追求實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，培養(yǎng)學(xué)生實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度。對(duì)一些不能開設(shè)的實(shí)驗(yàn)，通過演示實(shí)驗(yàn)的方式，拓寬學(xué)生視野，完善實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。學(xué)生都應(yīng)參加實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)環(huán)節(jié)，選作部分實(shí)驗(yàn)，了解植物生理的主要測(cè)試技術(shù)，在教師的指導(dǎo)下，獨(dú)立或團(tuán)隊(duì)操作，完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并用所學(xué)的知識(shí)，綜合分析，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告，解釋有關(guān)現(xiàn)象并討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)課程單獨(dú)考核，單獨(dú)記成績(jī)。一、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本要求二、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的目錄實(shí)驗(yàn)一種子生活力的快速測(cè)定--------------------------4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)二小藍(lán)子法測(cè)定植物的呼吸速率-------------------4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)三葉綠素a、b含量的測(cè)定---------------------------4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)四植物抗逆性的鑒定（電導(dǎo)儀法、丙二醛含量的測(cè)定、植物根系POD活性的測(cè)定）------------------------------------12學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)五改良半葉法測(cè)定植物光合速率（選做）--------4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)六谷類種子萌發(fā)時(shí)淀粉酶活性的測(cè)定（選做）--4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)種子生活力：是指種子能夠萌發(fā)的潛在能力或種胚具有的生命力。沒有生活力的種子是死亡的種子，不能萌發(fā)。種子壽命：種子從發(fā)育成熟到喪失生活力所經(jīng)歷的時(shí)間。種子壽命既與植物種類有關(guān)，也與貯藏條件（種子含水量、貯藏溫度）有關(guān)。正常性種子：水稻、玉米、小麥等種子（1-3年）短壽命：柳樹種子（12h）長(zhǎng)壽命：蓮子（400年）貯存條件：低溫、低濕，保存時(shí)間長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[種子生活力檢測(cè)評(píng)估方法](1)還原力：呼吸→NADH→還原TTC，胚呈紅色。(2)原生質(zhì)著色：活種子不易著色，原生質(zhì)膜具有選擇透性。(3)呼吸釋放CO2，pH下降，酸堿指示劑顯色。(4)細(xì)胞中的熒光物質(zhì)：紫外照射發(fā)藍(lán)、藍(lán)紫色熒光。(5)外觀目測(cè)法：用肉眼觀察玉米種胚形狀和色澤。凡種胚凸出或皺縮、顯黑暗無光澤的，則種子新鮮，生活力強(qiáng)，可作生產(chǎn)用種。(6)浸種催芽法先將100粒種子用水浸約兩小時(shí)吸脹，放于濕潤(rùn)草紙上，蓋以濕潤(rùn)草紙，置于氧氣充足，室溫10-20℃環(huán)境中，讓種子充分發(fā)芽；再以發(fā)芽的種子粒數(shù)除以100，乘以100%，求得發(fā)芽率。這種測(cè)定方法雖然準(zhǔn)確，但需要8天時(shí)間。實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯了解種子活力測(cè)定生產(chǎn)意義掌握重要種子活力測(cè)定方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)理解TTC/染料法測(cè)定種子活力的原理[實(shí)驗(yàn)原理]TTC法當(dāng)TTC溶液滲入種胚的活細(xì)胞內(nèi)，并作為氫受體被脫氫輔酶（NADH或NADPH）還原時(shí)，可產(chǎn)生紅色的三苯甲腙（TTF），胚染成紅色；如果種胚死亡則不能染色，種胚生命力衰退或部分喪失生活力則染色較淺或局部被染色。染料染色法有生命力種子胚細(xì)胞的原生質(zhì)膜具有半透性，有選擇吸收外界物質(zhì)的能力，一般染料不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，胚部不染色；而喪失生命力的種子，其胚部細(xì)胞原生質(zhì)膜喪失了選擇吸收能力，染料可以自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使胚部染色。實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[實(shí)驗(yàn)材料及藥品]不同活力的玉米和小麥種子0.5%氯化三苯四氮唑法（TTC法）紅墨水（稀釋20倍）刀片培養(yǎng)皿實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[實(shí)驗(yàn)步驟]一、氯化三苯四氮唑法（TTC法）1、原理凡是生活細(xì)胞，就有新陳代謝。滲入生活細(xì)胞的無色的TTC能被脫氫輔酶（NADH2或NADPH2）上的氫還原成紅色產(chǎn)物（TTF），肉眼可辨。2、材料：玉米、小麥（吸脹種子）3、方法：100粒種子，沿中心線縱切為二，做如下處理：

100半粒

+0.5%TTC→30℃，60min→

檢查

100半粒,煮沸5min

注意：胚為紅色的為具活力種子。4、作業(yè)：計(jì)數(shù)活種子數(shù)，計(jì)算活種子的百分率。實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[實(shí)驗(yàn)步驟]二、紅墨水染色法1、原理生活細(xì)胞的原生質(zhì)膜對(duì)物質(zhì)吸收有選擇性，而死細(xì)胞的無此功能，紅墨水顆?？梢赃M(jìn)入。2、材料：玉米、小麥（吸脹種子）3、方法種子100粒，沿中心線縱切為二，做如下處理：

100半粒

+5%紅墨水→室溫,60min→檢查

100半粒煮沸5min

注意：胚部著色（紅色）很淺或不著色者為生活種子，胚與胚乳著色程度相當(dāng)者為死種子。4、作業(yè)：計(jì)數(shù)活種子數(shù)，計(jì)算活種子的百分率。實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)]

1、種子要先軟化；

2、種子要沿種胚縱切為兩半；

3、顯色時(shí)要使漂浮的種子全部浸入試劑中；

4、TTC見光易分解，需在暗條件下保溫染色；

5、結(jié)果觀察主要是看胚部的顏色變化。實(shí)驗(yàn)一植物種子生活力的快速測(cè)定

(TTC法、染料染色法)[實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析]比較兩種種子活力的高低比較分析兩種方法測(cè)定結(jié)果的差異植物種子活力測(cè)定的其它方法實(shí)驗(yàn)二植物呼吸速率的測(cè)定——小籃子法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求掌握小籃子法測(cè)定植物種子呼吸速率的原理與步驟；比較活種子與死種子的呼吸速率。二、實(shí)驗(yàn)原理1、植物的呼吸作用定義：是植物體吸收氧氣，將有機(jī)物轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水并釋放能量的過程。葡萄糖+6O26CO2

+6H2O+能量意義：代謝的中心有機(jī)物轉(zhuǎn)化的樞紐能量的主要供應(yīng)渠道

2、測(cè)定呼吸速率的常用方法紅外線CO2氣體分析儀(IRGA)CO2可以吸收特定波段的紅外輻射。當(dāng)被檢CO2氣體通過IRGA的氣室時(shí)，可使紅外輻射減少或增加，且變化幅度取決于CO2的濃度。這種變化可被IRGA的檢測(cè)器所檢定，且以電訊號(hào)的形式輸出，由記錄儀所記錄。氧電極法3、小籃子法密閉容器中加入一定量堿液[一般用Ba(OH)2]，并懸掛植物材料，則植物材料呼吸放出的CO2可為容器中Ba(OH)2所吸收，然后用草酸滴定剩余的Ba(OH)2，從空白和樣品二者消耗的草酸溶液之差，可計(jì)算出呼吸釋放的CO2量具體反應(yīng)式：Ba(OH)2+CO2

BaCO3

+H2OBa(OH)2+H2C2O4

BaC2O4

+2H2O以酚酞指示滴定終點(diǎn)。1mL的1/44mol/L草酸溶液中的草酸與1mg的CO2等摩爾數(shù)?？瞻缀蜆悠范呦牡牟菟崛芤旱膍L數(shù)差值

=Ba(OH)2溶液吸收的CO2

mg數(shù)

=

種子呼吸作用釋放的CO2mg數(shù)三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑材料

小麥種子（浸種）和煮死的種子的小麥或綠豆種子；試劑的Ba(OH)2；

1/44mol/L的草酸；酚酞指示劑。1#種子2#實(shí)驗(yàn)裝置圖四、實(shí)驗(yàn)步驟取具玻璃塞和橡皮塞的500mL廣口瓶各1只，分別編號(hào)1#、2#；2.分別稱取10g煮死種子和浸種活種子，以紗布包裹，懸掛在橡皮塞下方；3.向兩瓶?jī)?nèi)各加入Ba(OH)2溶液20mL，立即封口，室溫放置。1#種子2#實(shí)驗(yàn)裝置圖不時(shí)輕搖兩瓶，1h后，拔除瓶塞，各加酚酞指示劑2滴，立即以塑料袋（保鮮膜）分別封口；將滴定管下端插入瓶中，以草酸滴定Ba(OH)2，記錄所用草酸體積V1和V2。五、計(jì)算呼吸速率(mgCO2/gFW.h)

=(V1-V2)/(W×t)六、思考題在本實(shí)驗(yàn)呼吸測(cè)定怎樣排除不應(yīng)有的干擾因素？在實(shí)驗(yàn)過程中為什么要輕搖廣口瓶數(shù)次？就計(jì)算公式而言，為什么草酸的用量可代表種子呼吸放出的CO2的量？草酸（1/44mol/L）滴定Ba(OH)2(0.05mol/L)，酚酞作指示劑，溶液由紫色變成無色，滴定至終點(diǎn)后，馬上顏色又由無色變成紫色，原因是什么？白天在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定植物莖葉的呼吸速率會(huì)受到什么影響？如何解決？如果實(shí)驗(yàn)材料選擇的是不同萌發(fā)階段的小麥種子及幼芽，哪一階段的呼吸速率最大？（結(jié)合實(shí)驗(yàn)1進(jìn)行分析）實(shí)驗(yàn)三

葉綠體色素的提取、分離、性質(zhì)及含量測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆杖~綠體色素的提取原理及方法；掌握葉綠體色素的部分理化性質(zhì)；掌握葉綠體色素定量分析方法及步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理2.類胡蘿卜素（一）葉綠體色素：胡蘿卜素葉黃素

葉綠素a葉綠素b1.葉綠素（二）四種色素的化學(xué)性質(zhì)均為親脂性>親水性：

均不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。極性大?。?/p>

葉綠素b>葉綠素a>葉黃素>胡蘿卜素

根據(jù)相似相溶原理，在有機(jī)溶液中的溶解度：

葉綠素b<葉綠素a<葉黃素<胡蘿卜素葉綠素的卟啉環(huán)葉綠素分子頭部的金屬卟啉環(huán)中心均為Mg2+。在弱酸作用下，葉綠素分子中的鎂可被H+

取代而形成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則可形成綠色的銅代葉綠素。銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易被破壞，故常用此法制做植物的原色標(biāo)本。（三）葉綠素的光學(xué)性質(zhì)

葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計(jì)精確測(cè)定。葉綠素的熒光現(xiàn)象葉綠素溶液在透射光下呈綠色，而反射光下呈紅色的現(xiàn)象。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑實(shí)驗(yàn)材料：綠色植物葉片實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：UV-1700分光光度計(jì)；天平；剪刀；打孔器；研缽；移液管；漏斗；量筒；培養(yǎng)皿；濾紙；95%乙醇；石英砂；CaCO3；醋酸銅四、實(shí)驗(yàn)步驟1、葉綠體色素提取將植物葉片擦凈，去中脈后取5g剪碎，加少許碳酸鈣和石英砂，再分次加入10mL酒精研磨，過濾，定容至50ml，分裝于5個(gè)試管內(nèi)，容量分別為10ml。23451

2.水研磨勻漿（光破壞對(duì)照）取2g剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水20ml，攪均，不過濾，分裝在2個(gè)試管內(nèi)。四、實(shí)驗(yàn)步驟光對(duì)葉綠素的破壞操作太陽光下：水（1）、乙醇（1）暗處（實(shí)驗(yàn)臺(tái)）：水（2）、乙醇（2）兩組（四管）3.光對(duì)葉綠素的破壞作用30分鐘后觀察各試管顏色的變化，并記錄，解釋現(xiàn)象

水研磨勻漿暗光

乙醇提取液暗光

注意：乙醇提取液的濃度太大，必須進(jìn)行稀釋才能做光破壞實(shí)驗(yàn)，稀釋倍數(shù)視提取液的濃度確定，濃度不要過大，否則在短時(shí)間之內(nèi)效果不明顯。4、葉綠素提取液熒光現(xiàn)象觀察取試管3：從與入射光垂直的方向觀察；再在透射光方向觀察葉綠體色素溶液的顏色；記錄葉綠素體色素溶液顏色有何不同，分析原因。5、銅代葉綠素反應(yīng)向試管4中逐滴加入濃鹽酸，并不斷搖勻，至顏色變化，觀察并記錄現(xiàn)象；向變色后的葉綠素溶液中加入少量醋酸銅，并在酒精燈上緩緩加熱，觀察并記錄顏色的變化。分析原因。6、葉綠素定量測(cè)定稀釋葉綠素取5號(hào)試管醇提取液5ml轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中（或更大，視濃度而定），再加入乙醇定容至50ml。測(cè)量光吸收

利用722分光光度計(jì)或UV1700分光光度計(jì)，分別測(cè)定葉綠素提取液在645nm和663nm下的吸光度。

實(shí)驗(yàn)原理

葉綠素提取液中同時(shí)含有葉綠素a和葉綠素b，二者的吸收光譜雖有不同，但又存在著明顯的重疊，在不分離葉綠素a和葉綠素b的情況下同時(shí)測(cè)定葉綠素a和葉綠素b的濃度，可分別測(cè)定在663nm和645nm（分別是葉綠素a和葉綠素b在紅光區(qū)的吸收峰）的光吸收，然后根據(jù)Lambert-Beer定律，計(jì)算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的濃度。A663ab（1）A645ab（2）公式中Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉綠素b濃度（單位為和9.27分別是葉綠素a和葉綠素b在663nm下的比吸收系數(shù)（濃度為1g/L，光路寬度為1cma和葉綠素b在645nm下的比吸收系數(shù)。即混合液在某一波長(zhǎng)下的光吸收等于各組分在此波長(zhǎng)下的光吸收之和。實(shí)驗(yàn)原理

將上式整理，可以得到下式：Ca663645（3）Cb645663（4）將葉綠素的濃度改為mg/L，則上式變?yōu)椋篊a663645（5）Cb645663（6）CT=Ca+Cb663645（7）CT為葉綠素的總濃度實(shí)驗(yàn)原理

定量測(cè)定結(jié)果分析

將測(cè)得的數(shù)值代入到公式（5）（6）（7）中，計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的濃度。最后要計(jì)算出單位葉片鮮重中葉綠素的含量：葉綠素a含量(mg/g鮮重)＝Ca×500ml（總體積數(shù)）×1ml/1000ml/L÷5g=a葉綠素b含量(mg/g鮮重)＝0.1Cb總?cè)~綠素含量(mg/g鮮重)＝0.1CT五、思考題：

1、用不含水的有機(jī)溶劑如無水乙醇、無水丙酮等提取干燥材料中的葉綠體色素，結(jié)果會(huì)如何？為什么？２、研磨提取葉綠素時(shí)，為何要加入CaCO3？

3、銅在葉綠素分子中具有替代鎂的作用，這有何實(shí)用意義？4、計(jì)算葉綠素a與葉綠素b含量的比值，可以得到什么結(jié)論？

實(shí)驗(yàn)四植物組織逆境傷害程度的測(cè)定

（提前20min-20oC速凍材料）電導(dǎo)法【實(shí)驗(yàn)原理】植物組織受到逆境傷害時(shí)，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，而使其透性增大，細(xì)胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)包括電解質(zhì)將有不同程度的外滲，將植物組織浸入無離子水中，水的電導(dǎo)將因電解質(zhì)的外滲而加大，傷害愈重，外滲愈多，電導(dǎo)度的增加也愈大。故可用電導(dǎo)儀測(cè)定外液的電導(dǎo)度增加值，從而得知傷害程度。校園中任意一種植物葉片電導(dǎo)法【實(shí)驗(yàn)材料】電導(dǎo)法【實(shí)驗(yàn)方法】1實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)處理：對(duì)照：正常植物葉片低溫：低溫（-20℃）處理20min的葉片2沖洗葉片，用濾紙吸干，打取葉圓片。每個(gè)試管10片葉，加入15ml蒸餾水后放入塑料沙網(wǎng)（距液面1cm）統(tǒng)一抽氣20min。3抽完氣后，平衡20-30min，其間不斷搖動(dòng)。4電導(dǎo)儀測(cè)定初電導(dǎo)值S1。5沸水浴10min，自來水冷卻（殺死植物組織），平衡10min（其間不斷搖動(dòng)）后即可測(cè)定終電導(dǎo)S2?！緦?shí)驗(yàn)方法】

取材各3片葉打取葉圓片

10片/管，15mL蒸餾水/管抽氣20min平衡20-30min測(cè)量S1煮沸15min冷卻平衡10min

測(cè)量S2【實(shí)驗(yàn)步驟示意圖】相對(duì)電導(dǎo)度：L=（S1-空白電導(dǎo)）/（S2-空白電導(dǎo)）傷害度（%）：(Lt-Lck/1-Lck)*100【結(jié)果計(jì)算】1蒸餾水中加吐溫(可用洗衣粉代替），洗儀器時(shí)出現(xiàn)泡沫。吐溫作用：表面活性劑，促進(jìn)細(xì)胞間隙水分與外界交換。2抽氣作用：抽出細(xì)胞間隙空氣，保證水分充分進(jìn)入細(xì)胞間隙。3紗網(wǎng)作用：防止抽氣時(shí)葉圓片被抽出?！咀⒁馐马?xiàng)】測(cè)定電解質(zhì)外滲液時(shí)，為何要對(duì)材料進(jìn)行真空滲入？測(cè)定過程中為何進(jìn)行震蕩？【思考題】

一原理

植物器官在逆境條件下或衰老時(shí),往往發(fā)生膜脂過氧化作用,丙二醛(MDA)是其中產(chǎn)物之一,通常將其作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo),用于表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。植物組織中丙二醛含量的測(cè)定丙二醛(MDA)硫代巴比妥酸(TBA)高溫酸性三甲基復(fù)合物(3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮)(紅棕色)上述反應(yīng)在532nm處有最大吸收波長(zhǎng)但此反應(yīng)受可溶性糖的極大干擾：糖與TBA的反應(yīng)產(chǎn)物在532nm處也有吸收(糖與TBA反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm處)＋所以，測(cè)定MDA含量時(shí)需排除可溶性糖的干擾根據(jù)Lambert-Beer定律，對(duì)最大吸收光譜不同的兩個(gè)組分的混合液,代入數(shù)值，計(jì)算得出混合液中兩種組分的濃度公式：可溶性糖：C1/(mmol/L)=11.71OD450MDA：C2/(μmol/L)=6.45OD532－0.56OD450

二材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料植物葉片(常溫和低溫兩種狀態(tài))(二)儀器設(shè)備研缽,試管,移液管,恒溫水浴鍋,離心機(jī),分光光度計(jì)

(三)試劑

10%三氯乙酸(TCA)0.6%硫代巴比妥酸(TBA)

三實(shí)驗(yàn)步驟(1)MDA的提取取葉片剪碎，加10%TCA2ml和少量石英砂，研磨，進(jìn)一步加入3mlTCA充分研磨，勻漿液以4000r/min下離心10min，上清液即為提取液，定容至10ml。(2)顯色反應(yīng)及測(cè)定吸取上清液2ml，加2ml0.6%TBA，混勻，在沸水浴中煮沸15min，迅速冷卻，在4000r/min下離心5min。取上清液測(cè)定532nm和450nm下的OD值。對(duì)照以2mlTCA代替提取液。四結(jié)果計(jì)算以測(cè)得的OD532減去OD600的非特異吸收值，按155mmol-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算MDA含量。分別計(jì)算衰老和對(duì)照組的值。MDA濃度

MDA含量(μmol/gFW)＝

D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)下的光密度值。五注意事項(xiàng)％的三氯乙酸對(duì)MDA-TBA反應(yīng)較合適，若高于此濃度，其反應(yīng)液的非專一性吸收偏高；MDA-TBA顯色反應(yīng)的加熱時(shí)間，最好控制沸水浴10-15min之間。時(shí)間太短或太長(zhǎng)均會(huì)引起532nm下的光吸收值下降；如待測(cè)液渾濁，可適當(dāng)增加離心力及時(shí)間，最好使用低溫離心機(jī)離心。低濃度的鐵離子能增強(qiáng)MDA與TBA的顯色反應(yīng)，當(dāng)植物組織中鐵離子濃度過低時(shí)應(yīng)補(bǔ)充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當(dāng)植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時(shí)可溶性糖含量會(huì)增高，必要時(shí)要排除可溶性糖的干擾。思考題1.通過丙二醛含量測(cè)定能夠解決什么理論和實(shí)際問題？2.說明膜脂過氧化作用的對(duì)植物的影響。3.TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？4.為什么要測(cè)定反應(yīng)液在600nm下的吸光度？5.丙二醛反應(yīng)液為什么加熱時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響測(cè)定結(jié)果？6.如果可溶性糖含量影響丙二醛含量的測(cè)定，你有什么辦法消除其影響？7.植物正常葉片與低溫凍害葉片相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。過氧化物酶活性的測(cè)定——愈創(chuàng)木酚比色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)比較植物根系或葉片過氧化物酶的制備方法2.掌握過氧化物酶的反應(yīng)原理及測(cè)定方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理什么是過氧化物酶?

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因?yàn)檫^氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)。酶活力表示酶量的多少不能像一般物質(zhì)那樣，用重量(g)或體積(ml)。因?yàn)槊甘且环N生物催化劑。酶的存在和含量多少應(yīng)體現(xiàn)在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力。催化能力強(qiáng)(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能說明酶的實(shí)際含量多少。同樣重量的酶，酶活力可以不同，活力高，價(jià)值就大。二、實(shí)驗(yàn)原理酶促反應(yīng)速度酶活力具體用它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示，即在最適條件下(最適pH、最適T)酶催化的反應(yīng)速度愈快，酶活力就愈高。速度愈慢，酶的活力就愈低。所以測(cè)定酶的活力(實(shí)質(zhì)上就是酶的定量)測(cè)定就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度(用v表示)。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物增加量來表示。單位：濃度/單位時(shí)間常用產(chǎn)物增加量表示，因?yàn)樗鼜臒o到有，變化明顯。酶促反應(yīng)隨時(shí)間增加，產(chǎn)物增加。二、實(shí)驗(yàn)原理酶促反應(yīng)的速度曲線Vmax時(shí)間產(chǎn)物的生成量斜率＝濃度/時(shí)間＝V從圖可知，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶反應(yīng)速度逐漸下降。引起下降的原因很多，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物對(duì)酶有抑制作用等。因此研究酶反應(yīng)速度以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)，即酶促反應(yīng)最初的一段時(shí)間，產(chǎn)物呈線性增加時(shí)的反應(yīng)速度。具體指酶促反應(yīng)速度曲線的斜率。即從原點(diǎn)對(duì)曲線作切線，求切線斜率(v)=濃度/時(shí)間二、實(shí)驗(yàn)原理測(cè)定原理RH2+H2O2→2H2O+R在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470