三HPLC分析方法的建立

第三講.HPLC分析方法的建立天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心BaseLine?目前一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)一.RPC分析方法建立二.NPC分析方法建立三.GPC分析方法四.HPLC應(yīng)用實(shí)例五.HPLC的定量分析目前二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)一.反相HPLC（RPC）分析方法的建立目前三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)建立分析方法的步驟樣品信息分析目的要求樣品制備選擇檢測方法和條件選擇HPLC方法優(yōu)化分離條件定性定量分析分析方法驗(yàn)證目前四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)樣品中的化學(xué)成分化合物的結(jié)構(gòu)與官能團(tuán)化合物的分子量化合物的酸堿性和pKa樣品適宜的溶劑及溶解度樣品各成分的含量范圍化合物的紫外吸收光譜樣品的組成與性質(zhì)目前五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)樣品的制備溶劑萃取固相萃取膜分離，超濾，超臨界萃取等目前六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)圖1非離子樣品的反相分離過程示意圖黑點(diǎn)表示在極性流動相和非極性固定相間分配的樣品分子RPC的保留機(jī)理目前七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)影響RPC的保留的因素：目前八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)1.流動相的影響：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷A+B：水+有機(jī)溶劑最佳分離條件：1<k<10目前九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)2.%B的選擇：目前十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)3.流動相強(qiáng)度：目前十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷目前十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)4.色譜柱和柱溫的影響：

非極性、非離子化合物的RPC保留值規(guī)則：(弱）未鍵合硅膠≤氰基<C1（TMS）<C3<C4<苯基<C8≈C18（強(qiáng)）通常柱溫增加1℃，K會減少1%-2%

目前十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)反相色譜的選擇性：溶劑強(qiáng)度的選擇性溶劑類型的選擇性柱類型對選擇性的影響溫度對選擇性的影響目前十四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)1.溶劑強(qiáng)度的選擇性

目前十五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)2.溶劑類型的選擇性

目前十六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)3.柱類型對選擇性的影響

目前十八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)4.溫度對選擇

性的影響：

目前十九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)反相色譜中分析方法的建立：反相方法建立的推薦步驟：1.調(diào)整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好）2.檢查峰拖尾或塔板數(shù)低的現(xiàn)象3.如果必要，調(diào)整選擇性a.微調(diào)%Bb.改變有機(jī)溶劑c.混合有機(jī)溶劑d.改變柱類型e.改變溫度4.優(yōu)化柱條件（柱長、顆粒尺寸、流速）目前二十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前二十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前二十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)混合溶劑的使用：目前二十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前二十四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)柱類型的影響：目前二十五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)不同溶劑與柱類型的結(jié)合使用：目前二十六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前二十七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)正相色譜分析方法的建立目前二十八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)1.樣品在RPC中不保留（親水性太強(qiáng)）2.樣品在RPC中保留太強(qiáng)（疏水性太強(qiáng)）3.采用RPC分離不能獲得足夠的峰間距（α=1）4.樣品含有空間異構(gòu)體，立體異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體5.期望回收到大量疏水性樣品組分（制備色譜）6.樣品溶于非極性溶劑（若采用RPC柱，會對直接進(jìn)樣造成問題）使用正相色譜（NPC）的理由：目前二十九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)正相色譜保留機(jī)理目前三十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前三十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前三十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)正相分析方法建立的推薦方法：

1.調(diào)整%B，使0.5<K<20，（氰基柱、己烷-丙醇做流動相）2.檢查峰拖尾現(xiàn)象3.如必要，調(diào)整選擇性a.微調(diào)%Bb.改變有機(jī)溶劑種類（MC、MTBE、EtAc）；微調(diào)%Bc.混合有機(jī)溶劑d.改變柱類型（二醇、氨基、硅膠）；微調(diào)%B4.優(yōu)化色譜柱條件（柱長、顆粒大小、流速）目前三十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前三十四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)NPC溶劑選擇性實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)色譜圖15×0.46cm硅膠柱，流動相如前，2.0ml/min，350C。樣品為取代萘混合物，取代基：12-OCH3，21-NO2，31，2-（OCH3）2，41，5-（NO2）2；51-CHO，82-CHO，91-CH2CN，101-OH，111-COCH3，122-COCH3，132-OH。目前三十五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)GPC分析方法目前三十六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)SEC保留機(jī)理目前三十七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前三十八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)GFC:凝膠過濾色譜水相流動相分離水溶性大分子固定相：多糖型凝膠、多孔交聯(lián)聚甲基丙稀酸酯類樹脂、交聯(lián)聚乙稀基醇樹脂、羥基化聚醚類親水性樹脂等。GPC:凝膠滲透色譜有機(jī)相流動相分離脂溶性高分子固定相填料：苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列目前三十九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)理想SEC填料的性能要求

目前四十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)

SEC填料的色譜特征：目前四十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)SEC應(yīng)用：分離復(fù)雜樣品，然后再以高分辨率的HPLC分離純化.分析純化高分子化合物，以確定單聚、二聚和多聚物.以校正曲線估算大分子物質(zhì)分子量.目前四十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前四十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前四十四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)實(shí)例:凝膠滲透色譜法測定羥乙基淀粉分子量色譜條件:1.色譜儀器：pharmaciaLKBHPLCpump2248KNAUERDifferental-referactometer2.色譜柱：ShodexOHpakSB-804HQ(聚羥甲基丙烯酸酯凝膠)規(guī)格：

柱名

排阻限(Pullulan)

粒徑(μm)

尺寸(mm)

SB-804

HQ

1,000,000

10

8.0

x

3003.流動相：0.7%硫酸鈉+0.02%疊氮化鈉4.流速：0.5ml/min5.柱溫：35℃目前四十六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟：1.選用分子量為2000000和180的兩種淀粉確定該色譜柱的檢測窗口,見圖一。

圖一：分子量為180的淀粉的色譜圖tR1:19.673min分子量為2000000的淀粉的譜圖tR0:12.902min目前四十七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)2.分別以分子量為11800、22800、47300、112000、212000淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，其相應(yīng)的GPC譜圖，見圖二。圖二：分子量為11800淀粉譜圖tR2：16.965分子量為22800淀粉譜圖tR2：16.230分子量為47300淀粉譜圖tR2：15.445分子量為112000淀粉譜圖tR2：14.930分子量為2000000淀粉譜圖tR2：13.720目前四十八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)3.標(biāo)定曲線的確定目前四十九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)4.未知淀粉譜圖

y=-2.692x+5.6637R2=0.9989X=(VR-VR1)/(VR0-VR1)tR1:19.673mintR0:12.902mintR1:14.530計算得：未知淀粉M=29046目前五十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)銀杏內(nèi)酯色譜條件：色譜柱：BaselineC184.6×150mm,5μm流動相：甲醇：水：四氫呋喃=25：65：10流速：1ml/min檢測：ELSD,蒸發(fā)管溫度85℃，氣體流速4.0Bar目前五十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)系統(tǒng)評價峰號峰名保留時間/min峰面積mAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1銀杏內(nèi)酯A6.247158814.3445146.719/1.1742銀杏內(nèi)酯B7.615402280.1886086.1683.1611.1443白果內(nèi)酯8.870418603.3446992.2792.6221.0914銀杏內(nèi)酯C11.713330196.2507052.8474.8990.981目前五十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)

五種二氫吡啶類藥物色譜條件：色譜柱：BaselineC184.6×250mm,5μm流動相：甲醇：水=75:25流速：1ml/min檢測：UV237nm目前五十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)系統(tǒng)評價峰號峰名保留時間/min峰面積mAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1雜質(zhì)12.74567928.125/1.8181/2硝苯地平4.927294767.2507041.1491.4751.4153尼群地平8.078648196.7508204.8964.0431.2834尼莫地平9.060810590.8758377.0292.2371.2605非洛地平14.5971114624.25010027.2095.3661.2556拉西地平25.787691817.81310525.8752.9571.229目前五十四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)酚咖片色譜條件：色譜柱：BaselineC18,4.6×250mm,5μm流動相：甲醇：水：冰醋酸=32：65：3流速：1ml/min檢測：UV275nm目前五十五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)酚咖片色譜圖（d/qhq/酚咖片/B0029,5.0μl）系統(tǒng)評價峰號峰名保留時間/min峰面積MAUs塔板數(shù)(N)分離度(Rs)拖尾因子USPTf1撲熱息痛3.812285765.188///2咖啡因6.008183115.5476073.3806.2261.4383阿司匹林14.447180600.40612993.96617.5691.2174苯甲酸20.563475402.96916084.1758.9951.172目前五十六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前五十七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前五十八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前五十九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前六十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前六十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前六十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)五.HPLC定量分析方法目前六十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)

1.歸一化法：以峰面積為基礎(chǔ)的歸一化法加校正因子的歸一化法2.外標(biāo)法：外標(biāo)曲線法外標(biāo)一點(diǎn)法3.內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)曲線法內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)加校正因子法4.標(biāo)準(zhǔn)加入法目前六十四頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)1.歸一化法：1.1以峰面積為基礎(chǔ)的歸一化法1.2加校正因子的歸一化法

相對校正因子：目前六十五頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)2.外標(biāo)法

2.1外標(biāo)曲線法目前六十六頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)2.2外標(biāo)一點(diǎn)法：目前六十七頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前六十八頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)目前六十九頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法目前七十頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)3.1內(nèi)標(biāo)曲線法目前七十一頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)3.2內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：目前七十二頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)3.3內(nèi)標(biāo)加校正因子法：相對校正因子：目前七十三頁\總數(shù)七十八頁\編于二十點(diǎn)例2校正因子法的測定復(fù)方炔諾酮片中炔諾酮的含量ODS色譜柱、甲醇－水（60：40）流動相、監(jiān)測器UV280nm、對硝基甲苯為內(nèi)標(biāo)物。（1）校正因子的測定：取對硝基甲苯（內(nèi)標(biāo)物）、炔諾酮和炔雌醇對照品適量，用甲醇制成10ml容量，進(jìn)樣10ul，記錄色譜圖。重復(fù)3次。測得含0.0733ml/ml內(nèi)標(biāo)物、0.600mg/ml炔諾酮和0.035mg/m