DNA自身抗體的及其臨床應(yīng)用

蘭小鵬簡介

1959.3出生，醫(yī)學(xué)博士，主任技師，教授；南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心副主任、檢驗(yàn)科主任，中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)血栓和止血專家委員會(huì)委員、南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)主任委員、南京軍區(qū)器官移植研究所副所長、福建省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)副主任委員、第二軍醫(yī)大學(xué)和福建醫(yī)科大學(xué)碩士研究生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樽陨砻庖卟〉膶?shí)驗(yàn)診斷以及腫瘤的基因治療。獲軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng)、三等獎(jiǎng)一項(xiàng)、四等獎(jiǎng)一項(xiàng)、榮立三等功一次；被評(píng)為南京軍區(qū)“優(yōu)秀中青年科技人才”；發(fā)表論文30余篇，參編專著三部。

自身免疫病是一大類以產(chǎn)生各種各樣的自身抗體為特征的全身或局部性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、皮肌炎、硬皮病以及免疫性不孕癥等，其較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的危害程度越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗體譜，因此自身抗體的研究對(duì)自身免疫病的診斷、鑒別診斷、治療及療效監(jiān)測均有重要的意義。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的自身抗體將近100種，應(yīng)用于臨床的自身抗體也已達(dá)數(shù)十種。新的自身抗體還在不斷的被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。DNA自身抗體作為一種經(jīng)典的且被廣泛應(yīng)用的自身抗體，在自身免疫病的研究中發(fā)揮了重要的作用。但DNA作為一種特殊的自身抗體，還存在許多未解之謎，因此，人們對(duì)DNA自身抗體的研究和探索始終沒有停止。本次講座主要討論一下DNA抗原以及其相對(duì)應(yīng)的DNA自身抗體的研究和臨床應(yīng)用。DNA自身抗體的研究進(jìn)展南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍檢驗(yàn)中心CenterforLabMedicinePLACenterforLabMedicinePLA蘭小鵬一、DNA抗原的分子特性

1.DNA分子的基本構(gòu)象：右手雙螺旋（B-DNA）左手雙螺旋DNA（Z-DNA）B-DNA和Z-DNA又稱雙鏈DNA（doublestrandedDNA,ds-DNA)或天然DNA（nativeDNA,nDNA)單鏈DNA(singlestrandedDNA,ss-DNA)或稱變性DNA．

2.DNA分子的抗原特性１)不同構(gòu)象的分子之間的抗原性差別甚大，但又彼此交叉，還可互相轉(zhuǎn)變。２）DNA分子具有多抗原決定簇的特點(diǎn)：與抗體結(jié)合時(shí)的親和力較高。３）DNA抗原具有多聚陰離子特性：易產(chǎn)生非特異結(jié)合反應(yīng)。４)ds-DNA的抗原決定簇存在于ds-DNA分

子的構(gòu)象之中。

５）DNA抗體與DNA的結(jié)合能力與DNA抗原的分子量有一定的關(guān)系，分子量越大，結(jié)合率越高。只有35bp以上的片段才能有效地與抗ds-DNA抗體結(jié)合。６）DNA抗體與DNA的結(jié)合能力與DNA抗原分子的堿基組成有關(guān)：G+C含量高的DNA分子更易與抗體結(jié)合。７）DNA分子中含有某些復(fù)雜或特殊的結(jié)構(gòu)時(shí)，更易與抗體結(jié)合：如含有較多的重復(fù)序列、CpG及甲基胞密啶(mC)。

二．Ds-DNA分子的免疫原性１.用常規(guī)的免疫方法，ds-DNA一般不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。２.來源于原核生物的ds-DNA比真核生物的ds-DNA更容易通過免疫動(dòng)物來制備抗體。３.在某些特定的情況下，真核細(xì)胞的ds-DNA才具有免疫原性。

三．DNA的單克隆自身抗體

與常規(guī)的單克隆技術(shù)相比，自身單克隆抗體的制備更為簡便，不需要人工免疫動(dòng)物，直接將自身免疫病的動(dòng)物模型的脾細(xì)胞或病人的外周血淋巴細(xì)胞與相應(yīng)的瘤細(xì)胞株融合就可建立雜交瘤，采用不同的抗原進(jìn)行篩選，則可獲得多種單克隆抗體。

按融合細(xì)胞的來源不同，DNA抗體的雜交瘤可分為三類：1.鼠－鼠雜交瘤：將近交的SLE小鼠模型的脾細(xì)胞與鼠的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。2.人－鼠雜交瘤：用SLE病人能分泌DNA抗體的B細(xì)胞與鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合。３.人－人雜交瘤：用SLE病人的外周血淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞與人的骨髓瘤細(xì)胞融合。另外將經(jīng)過EB病毒轉(zhuǎn)化的SLE病人的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行克隆，這種轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞亦可分泌抗ds-DNA。此法更為簡便，因?yàn)榧?xì)胞融合的步驟也不需要了，但這種EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的量比較少。

人－人DNA雜交瘤及其分泌的抗DNA抗體研究的意義：1.通過分析單克隆抗體的特異性，可以更進(jìn)一步地了解DNA在SLE中的作用。2.作為抗原，DNA抗體又可誘導(dǎo)抗DNA抗體的獨(dú)特型抗體。這種抗獨(dú)特型有助于研究SLE產(chǎn)生DNA抗體的調(diào)控機(jī)制。3.這種雜交瘤細(xì)胞本身可用于分析與自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)的基因結(jié)構(gòu)。

DNA的單克隆抗體存在的問題1.代表性的問題：作為一種多抗原決定簇的分子，由其引發(fā)的免疫反應(yīng)包含了許許多多針對(duì)不同抗原決定簇的多克隆抗體。顯然，只針對(duì)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)決定簇的單克隆抗體，代表不了DNA引起的整個(gè)免疫反應(yīng)。2.單克妥隆抗榴體可序能因昌靜電號(hào)引力乎與“南粘性否”分堵子呈遭非特肝異結(jié)印合。3.由于灶不同止來源堵的分兔子之烘間的列相似榜性以亭及某失些在浪化學(xué)倘結(jié)構(gòu)弄和性仍質(zhì)上戲與DN法A相似拍的化貪合物智的存你在，是使DN務(wù)A單克社隆抗桿體的控交叉晉反應(yīng)暫顯得座尤為燦突出耽。四．DN付A抗體猶的交徒叉反靠應(yīng)幾乎懶所有皆的DN晴A單克膨隆和咳多克漁隆抗運(yùn)體既謝能與ds-D幅NA又可魄與ss－DN份A反應(yīng)衣，而遮且在鄉(xiāng)豐多數(shù)趟情況油下，DN影A抗體租與ss－DN侮A的親玻和力背更高爛。但是漫單純睡針對(duì)ss－DN晌A的抗ss－DN慕A抗體凡則只縣能與ss－DN歲A結(jié)合營不能琴與ds-D概NA結(jié)合唯。DN算A抗體役能結(jié)燦合的否分子疲包括Z－DN能A、某些付人互稈合成祥的多返核苷質(zhì)酸如po塘ly苦(I)、po紹ly濟(jì)(d輪T)、po查ly鋤(d命Ad忌T)，PO找LY借(d新Gd難C)等。引不少效多聚好陰離哲子化鞠合物晝?nèi)缧母袅字推鋰L它磷策脂、籌硫酸芳右旋己糖酐貸、透躺明質(zhì)冬酸和爺硫酸教軟骨少素以碼及硫償酸肝蔥素等渣都可壯與ds-D脹NA抗體律結(jié)合酸。研究避和了任解抗DN賤A的交只叉反失應(yīng)的血臨床消意義污：1.解釋SL魄E病人滴出現(xiàn)題梅毒冰試驗(yàn)田陽性寺的現(xiàn)螞象。2.利用戴抗ds-D拆NA抗體游與硫隊(duì)酸右玩旋糖睜酐（DS）的反般應(yīng)，這可將DS吸附幼在硝住酸纖司維素漠柱上邁，用恭來去飛除SL踏E病人傲血中樣的抗ds-D叼NA抗體華。3.對(duì)抗ds-D鏈NA抗體忙和ds-D調(diào)NA在SL鈔E的發(fā)撐病機(jī)陪制中童的重句新評(píng)禮價(jià)。傳統(tǒng)勁的觀慎點(diǎn)：免疫冶復(fù)合怎物沉丟積學(xué)拔說。新的啊觀點(diǎn)蜓：DN修A抗體年可能咳通過蠅與腎鞠小球火某些唐成分緊上的佩抗原墻的交跟叉反眾應(yīng)，嫁或者魯通過耳電荷杯的作抽用，汽直接獨(dú)結(jié)合絹在腎職小球庫基底倆膜上攏，產(chǎn)巴生阻心塞或炕導(dǎo)致訴補(bǔ)體哄介導(dǎo)政的炎亮癥和拖組織省損害端。五．DS辟-D揚(yáng)NA抗體窩的獨(dú)逢特型獨(dú)特也型(Id找io右ty樣pe崇,I曠d)：通常出是指根位于檔抗體鹿可變局區(qū)的吊抗原嗚決定期簇。私有Id而(p牛ri宅va言te頌I突d)：只存辦在于娛某一避種類汪型抗淘體中恥的Id。公共Id歇(p希ub上li得c茂Id芬)：幾種仆或多貨種抗飛體共勝同擁淚有的Id。16艇/6公共Id：在活木動(dòng)性償?shù)腟L拾E中，青有厲一半皆以上爹的病桂人血踢清中邪的DN叨A抗體先帶有壓的一鴨種公洲共Id。16遍/6廢Id與SL述E的活陣動(dòng)性厘有關(guān)初，病否情活衰動(dòng)時(shí)咱，16損/6倦Id的滴狐度上完升，迷反之附則下同降，SL醋E病人圖受損剃的組耐織中膊亦顯棕示有16慮/6的沉霧積。研究16恢/6美Id的重姨要意幟義是透：16則/6贏Id可以掉誘導(dǎo)仔正常娛的小買鼠發(fā)另展成SL顫E。因此SL高E極有就可能武是一甜種由Id誘導(dǎo)陣的疾壺病。兩種酬假設(shè)超：1.申6/跳6I稍d（Ab滔1）免疫炭小鼠邪，刺斷激產(chǎn)漠生了砌抗－16遙/6繁Id（Ab丸2），Ab蘋2又可楚刺激毒小鼠程產(chǎn)生啦抗－疑抗－16排/6想Id（Ab看3）。Ab鎮(zhèn)3則帶蜜有原盟來的脹病理啟性16需/6健Id，這種步抗體煌可能敗就是聾抗－DN懼A抗體績，后述者可仙導(dǎo)致SL欄E的發(fā)昌生。2.針對(duì)16能/6腎Id的抗膽－16猜/6厲Id與自診身抗摸原（DN球A）相似推。因你此，繁這種屑抗16摔/6矩Id的產(chǎn)恰生又搏使小崖鼠產(chǎn)輕生抗女－抗克－6/貿(mào)6I匪d，后者維可與DN稅A反應(yīng)氣。六．威抗ds-D戚NA的檢繳測1.免疫棄螢光莊法（IF巧T）2.放射布免疫鋤法（RI印A）3.臣EL笨IS部A4.斑點(diǎn)貸免疫慕金滲引濾法直（DI跑GF茫A）5.生物址芯片串法優(yōu)點(diǎn)礦：1.目前態(tài)仍為步檢測柴抗ds－DN億A抗體董的金上標(biāo)準(zhǔn)禽。2.特異啞性高3.可同柔時(shí)檢戰(zhàn)測AN趴A和抗ds－DN愚A抗體悔。4.可半私定量帽檢測圖抗ds－DN候A抗體泄（滴粘度）毒。缺點(diǎn)駝：1.敏感焰性不必高。2.短膜桂蟲的誘培養(yǎng)病和傳賭代比踏較費(fèi)舒時(shí)費(fèi)爸事。3.操作位方法斬也比乒較煩囑瑣、高不易網(wǎng)標(biāo)準(zhǔn)馳化。4.近幾輪年也墨有假促陽性自報(bào)道慘。優(yōu)點(diǎn)冰：1.敏感蝦性較潔高。2.可以麻定量軋測定ds－DN松A抗體佛。缺點(diǎn)尼：1.假陽填性率腳較高心。2.有放羅射性罩污染話。。優(yōu)點(diǎn)間：1.方法向比較逆穩(wěn)定講，應(yīng)亮用廣右泛。2.可以皺定量亦，但羨多數(shù)沫情況穩(wěn)下只修是定叼性測區(qū)定。缺點(diǎn)哪：1.試劑導(dǎo)盒大田多為屆進(jìn)口串產(chǎn)品飽，價(jià)貫格較瞎高。2.操作姐步驟準(zhǔn)較多瓜，比震較費(fèi)附時(shí)。優(yōu)點(diǎn)凍：1.快速諒、簡歌便，縮慧只需2分鐘貓，2個(gè)步通驟。2.敏感隸性與EL海IS僵A相當(dāng)鄭，特傭異性他與免純疫熒鵝光法河相近鉗。缺點(diǎn)攏：不能籃定量己。優(yōu)點(diǎn)隔：1.高通予量，脾可同謠時(shí)檢涂測多嘴份標(biāo)似本，輛多種據(jù)自身絞抗體已。2.可定情量測跟定。缺點(diǎn)喇：成本喬較高凈，可生通過甘靈活互多樣哄的組給合降喊低成雖本。流式極熒光右檢測兵儀Lu膚mi細(xì)ne噸x10銷0多功書能流吉式點(diǎn)使陣儀流式囑熒光炸檢測尚儀流式將熒光莊技術(shù)流式章熒光薪技術(shù)——激光蜂激發(fā)博熒光莊的發(fā)帆光類晃技術(shù)照之一(Be擠ad土B肉as確ed禍)臨Su梯sp糠en稀si葛on齒A滑rr鵝ay（基惡于微份珠的您）懸墨浮陣期列Li徒qu疼id技Ch或ip（QI藍(lán)AG撈EN）液態(tài)侍芯片循、液碌體芯抗片、希液相栗芯片F(xiàn)l執(zhí)ex恒ib桑le肺M擺ul呈ti逐-An將al賢yt培ePr扇of冬il串in明g聽sy灶st農(nóng)emxM氏AP多功謊能多陰指標(biāo)規(guī)并行餐分析可系統(tǒng)Be奮ad宜/Mi跡cr歷os屆ph亂er褲eAr嶼ra賤y微珠辰陣列熒光命編碼浩微球言技術(shù)共價(jià)左交聯(lián)誤技術(shù)CONH蛋白壯、核鑼酸反暴應(yīng)模桂式核酸抗原抗體AFPCEANSECA125CA242F-PSAT-PSA