重組與克隆詳解

重組與克隆詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)優(yōu)選重組與克隆目前二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn) DNA重組對(duì)生物進(jìn)化，物種多樣性和種群內(nèi)的遺傳多樣性起著關(guān)鍵的作用。

基因突變:有利突變，有害突變

生物如何積累有利突變，淘汰有害突變？ DNA重組能迅速增加群體的遺傳多樣性(diversity)，通過優(yōu)化組合(optimization)積累有利突變，推動(dòng)生物進(jìn)化。目前三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱DNA克隆或分子克隆(molecularcloning)，也可稱作重組DNA技術(shù)，或基因工程。

基因工程技術(shù)制造生物制品。

定向改變生物的遺傳特性，使生物體獲得某些優(yōu)良性狀。轉(zhuǎn)基因食品安全?

基因治療,

安全性?

目前四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1同源重組

同源重組(homologousrecombination)發(fā)生在同源DNA片段之間，是在兩個(gè)DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換的一種重組形式。不同來源或不同位點(diǎn)的DNA，只要二者之間存在同源區(qū)段，都可以進(jìn)行同源重組。由于其廣泛存在，亦稱一般性重組(generalrecombination)。

細(xì)菌的接合(conjugation)、轉(zhuǎn)化(transformation)和轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)，以及真核細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間發(fā)生的交換等都屬于同源重組。目前五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.1同源重組的分子模型6.1.1.1Holliday模型

Holliday模型由美國科學(xué)家Holliday于1964年提出。

(1)切割2條同源DNA各有1條鏈在相同的位置被特異性的內(nèi)切酶切開。

(2)交叉和連接被切開的鏈交叉，并與另一個(gè)分子的同源鏈連接，分子彎曲形成Holliday連接。(3)拆分，產(chǎn)生重組體補(bǔ)丁重組體(patchrecombinantheteroduplex)。拼接重組體(splicerecombinantheteroduplex)

目前六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

(1)切割2條同源DNA各有1條鏈在相同的位置被特異性的內(nèi)切酶切開。

(2)交叉和連接被切開的鏈交叉，并與另一個(gè)分子的同源鏈連接，分子彎曲形成Holliday連接。(3)拆分水平方向的切割(WE裂解)，由此產(chǎn)生的重組體制交換了DNA的一個(gè)小片段，稱補(bǔ)丁重組體(patchrecombinantheteroduplex)。垂直方向的切割(NS裂解)，由此產(chǎn)生的重組體有一條鏈由兩個(gè)DNA分子的鏈拼接而成，稱拼接重組體(splicerecombinantheteroduplex)。目前七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄目前八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

Potter和Dressler在電鏡下看到的Holliday中間體的結(jié)構(gòu)(圖6-2)，是對(duì)Holliday模型強(qiáng)有力的支持。目前九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

盡管Holliday模型能解釋重組的許多特征，但也有某些不足。其一，DNA重組時(shí)，通常有一個(gè)分子是供體，另一個(gè)是受體，而Holliday模型無法區(qū)分供體和受體。其二，Holliday模型需要兩個(gè)DNA分子各有一條鏈在同一位置被切割，目前尚未發(fā)現(xiàn)完成這一過程的確切機(jī)制。目前十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.1.2單鏈斷裂模型(thesingle-strandedbreakmodel)，單鏈斷裂模型認(rèn)為，在同源區(qū)時(shí)，只有供體分子產(chǎn)生一個(gè)單鏈切口，形成DNA單鏈，并入侵受體DNA分子，形成Holliday結(jié)構(gòu)。其后進(jìn)行的交叉點(diǎn)移動(dòng)，和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分，與Holliday模型相同。單鏈斷裂模型能很好的解釋細(xì)菌的接合作用和轉(zhuǎn)化等原核生物的同源重組，以及DNA損傷的重組修復(fù)。目前十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.1.3雙鏈斷裂模型

雙鏈斷裂模型(thedouble-strandedbreakmodel,DSB)認(rèn)為，受體雙鏈(recipientduplex)兩條鏈的斷裂啟動(dòng)了鏈的交換，不產(chǎn)生斷裂的被稱為供體雙鏈(donorduplex)。隨后發(fā)生的DNA修復(fù)合成以及切口連接導(dǎo)致形成兩個(gè)Holliday連接。

DNA受到的雙鏈斷裂損傷，可以通過同源重組來修復(fù)，在修復(fù)損傷的同時(shí)，進(jìn)行基因重組。

真核生物的細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)的同源重組，符合雙鏈斷裂模型。目前十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

(1)內(nèi)切酶切開受體雙鏈DNA分子同源區(qū)的兩條鏈，啟動(dòng)重組過程(圖6-3a)。

(2)在外切酶的作用下，雙鏈切口擴(kuò)大，產(chǎn)生兩個(gè)具有3'-末端的單鏈區(qū)，并形成一個(gè)缺口(圖6-3b)。

(3)一個(gè)自由的3'-端入侵供體雙鏈DNA分子的同源區(qū)，形成異源雙鏈，供體雙鏈的一條鏈被取代，產(chǎn)生取代環(huán)(adisplacementloop,D環(huán),圖6-3c)。

(4)人侵的3‘-端引發(fā)以被人侵DNA鏈為模板的DNA合成，導(dǎo)致D環(huán)擴(kuò)大。以D環(huán)的單鏈為模板，填補(bǔ)受體鏈上的缺口(圖6-3d)。

(5)DNA連接酶連接切口，形成兩個(gè)Holliday連接，即聯(lián)結(jié)體x和聯(lián)結(jié)體y(圖6-3e)。

(6)Holliday連接的拆分有4種可能。目前十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.2細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組6.1.2.1細(xì)菌的接合作用(conjugation)

細(xì)菌的細(xì)胞相互接觸時(shí)，遺傳信息可在接合質(zhì)粒的參與下，由一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞，稱為接合作用。目前十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子(fertilityfactor)，簡(jiǎn)稱性因子或F因子。

F+菌株，F(xiàn)因子獨(dú)立存在.Hfr菌株：F因子插入到染色體DNA上。F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收。目前十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)F因子通過結(jié)合作用由F+細(xì)胞向F–細(xì)胞轉(zhuǎn)移的電鏡照片。F+細(xì)胞的性菌毛與F-細(xì)胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT上，切開一條鏈，使其5'端進(jìn)入受體細(xì)胞，并合成其互補(bǔ)鏈，使F–細(xì)胞轉(zhuǎn)化為F+細(xì)胞，給體細(xì)胞中的單鏈也可以合成互補(bǔ)鏈。目前十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.2.2細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化(genetictransformation)

遺傳轉(zhuǎn)化指細(xì)菌吸收外源DNA(轉(zhuǎn)化因子)而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。能攝取DNA分子的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。自然轉(zhuǎn)化是細(xì)菌遺傳信息轉(zhuǎn)移和重組的一種重要方式，但多數(shù)細(xì)菌在自然條件下不發(fā)生轉(zhuǎn)化，或轉(zhuǎn)化效率很低。在科研工作中，通常用高濃度Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)，提高轉(zhuǎn)化率。目前十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化目前十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。目前十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.2.3細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過噬菌體將細(xì)菌基因從供體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。

當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體）釋放出來，再次感染另一細(xì)胞（受體）時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。目前二十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)溶菌感染重組感染細(xì)菌噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組目前二十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.2.4細(xì)菌的細(xì)胞融合

用溶菌酶除去兩個(gè)菌株的細(xì)胞壁，使之成為原生質(zhì)體。然后，人工促進(jìn)原生質(zhì)體的融合，這便是細(xì)菌的細(xì)胞融合(cellfusion)。細(xì)胞融合后，兩個(gè)菌株的DNA發(fā)生廣泛的基因轉(zhuǎn)移和重組。目前二十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.3細(xì)菌同源重組的酶學(xué)機(jī)制（1）χ（Chi）位點(diǎn)和RecBCD(外切核酸酶Ⅴ)的作用

χ位點(diǎn)是RecBCD作用的調(diào)控位點(diǎn).

RecBCD是一種多功能酶，具有3種酶活性：①依賴于ATP的外切核酸酶活性；②可被ATP增強(qiáng)的內(nèi)切核酸酶活性；③ATP依賴的解旋酶活性。當(dāng)DNA分子斷裂時(shí)，它即結(jié)合在其游離端，使DNA雙鏈解旋并降解。

目前二十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)RecA蛋白的帶狀圖解

RecA蛋白R(shí)ecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合形成每圈含6個(gè)單體的螺旋纖絲(helicalfilament)。促進(jìn)同源重組過程中DNA單鏈的入侵。RecA可以與雙鏈DNA作用，在此過程中，由RecA水解ATP提供反應(yīng)所需能量。目前二十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

首先，RecBCD結(jié)合到DNA的末端，并使DNA解旋。

接著SSB和少量的RecA結(jié)合到單鏈區(qū)，RecBCD從末端起切割單鏈，3‘-端比5'-端快。

當(dāng)酶切位點(diǎn)移動(dòng)到χ位點(diǎn)附件時(shí)，3‘-端的水解停止，5’-端的水解速度加快，產(chǎn)生具有3‘-端的游離單鏈。在此過程中，RecA取代SSB與游離單鏈結(jié)合。目前二十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)RecA的作用分為3個(gè)階段：①在前聯(lián)會(huì)(presynapsis)階段，RecA分子通過其第一DNA結(jié)合位點(diǎn)與單鏈DNA結(jié)合。②在聯(lián)會(huì)前(synapsis)階段，RecA分子通過其第二DNA結(jié)合位點(diǎn)與另一個(gè)DNA雙螺旋結(jié)合，形成三鏈DNA中間體，隨后，單鏈DNA入侵雙鏈DNA，并快速掃描搜索同源區(qū)。③在鏈交換階段，入侵的單鏈DNA置換雙螺旋的一條鏈，產(chǎn)生雜合DNA雙螺旋(圖6-6)。Holliday中間體已經(jīng)形成。

（2）RecA蛋白引起DNA同源重組目前二十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)RecA蛋白引起DNA同源重組的模型目前二十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)（3）Ruv蛋白和Holliday聯(lián)結(jié)體的拆分

Holliday中間體移動(dòng)時(shí)，需要兩個(gè)DNA分子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。RuvA和RuvB蛋白在推動(dòng)DNA分子旋轉(zhuǎn)中起關(guān)鍵作用。RuvA蛋白能夠識(shí)別Holliday聯(lián)結(jié)體的交叉點(diǎn)，還可幫助RuvB結(jié)合在雙鏈DNA上。RuvB是一種解螺旋酶。通過水解ATP而推動(dòng)交叉點(diǎn)的移動(dòng)。Holliday聯(lián)結(jié)體最后由RuvC拆分，并由DNA聚合酶和DNA連接酶進(jìn)行修復(fù)合成。(圖6-7)。

目前二十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)假設(shè)的RuvA四聚體與Holliday位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型。目前二十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.4真核生物的同源重組6.1.4.1減數(shù)分裂中的同源重組

真核生物的同源重組主要發(fā)生在細(xì)胞減數(shù)分裂前期I兩個(gè)配對(duì)的同源染色體之間(非姊妹染色單體)，先在細(xì)線期(leptotene)和合線期(zygotene)形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體(synaptonemalcomplex,SC)，再在粗線期(pachytene)進(jìn)行交換。目前三十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)(1)Spol1蛋白切割DNA雙鏈。

(2)MRX酶復(fù)合物催化的5‘→3’切除。MRX酶復(fù)合物與細(xì)菌的RecBCD沒有同源性，但在同源重組中所起的作用與RecBCD相似。

(3)Rad51和Dmc1與單鏈DNA結(jié)合，Rad51和Dmc1的作用與細(xì)菌的RecA蛋白相似，二者均可形成絲狀聚集體，并與單鏈DNA結(jié)合，促進(jìn)非姐妹染色體之間的鏈交換。

(4)多種蛋白質(zhì)促進(jìn)減數(shù)分裂時(shí)的同源重組，形成了由多種蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合體，被稱作重組工廠(recombinationfactory)。目前三十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.1.4.2基因轉(zhuǎn)換在同源重組過程中，Holliday中間體拆分時(shí)，發(fā)生DNA片段的交互重組。在真核生物中，還有另一種機(jī)制，基因只發(fā)生單向的轉(zhuǎn)移，稱基因轉(zhuǎn)換(geneconversion)。

目前三十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

交配型轉(zhuǎn)換的機(jī)制如圖6-9所示，這一過程的第一階段與同源重組相似，只是進(jìn)行雙鏈切割的酶是特異性的核酸內(nèi)切酶，稱HO內(nèi)切核酸酶。鏈入侵之后，只有其中一個(gè)基因(a基因)的序列被復(fù)制，另一個(gè)基因(α基因)的單鏈序列則被切除?？偟慕Y(jié)果是基因轉(zhuǎn)換，而不是進(jìn)行相互交換的基因重組。目前三十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.2位點(diǎn)特異性重組6.2.1位點(diǎn)特異性重組的機(jī)制

位點(diǎn)特異性重組(site-specificrecombination)指發(fā)生在DNA特異性位點(diǎn)上的重組，廣泛存在于各類細(xì)胞中。其主要作用包括某些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)育過程中DNA的程序性重排，以及有些病毒和質(zhì)粒DNA復(fù)制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除等。目前三十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)此過程往往發(fā)生在重組位點(diǎn)(20～200bp)。位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果決定于重組位點(diǎn)的位置和方向。如果兩個(gè)重組位點(diǎn)以相反方向存在于同一DNA分子上，重組的結(jié)果是兩個(gè)重組位點(diǎn)之間的DNA片段發(fā)生倒位。若重組位點(diǎn)以相同方向存在于同一DNA分子上，重組結(jié)果是兩個(gè)重組位點(diǎn)之間的DNA片段被切除。(圖6-10)。目前三十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)位點(diǎn)特異性重組的主要步驟

(1)兩個(gè)酶分子通過酪氨酸Tyr-OH進(jìn)攻識(shí)別序列上的1個(gè)特定的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致2個(gè)DNA分子各有1條鏈被切開，其中5'-磷酸基與Tyr-OH以磷酸酯鍵相連。

(2)兩個(gè)切點(diǎn)之間發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，從而形成Hollida連接，使兩個(gè)雙鏈分子中各自的一條鏈發(fā)生了交換。

(3)在短距離的交叉點(diǎn)遷移后，另外兩個(gè)酶分子在2個(gè)DNA分子上的另一條鏈上產(chǎn)生切口，反應(yīng)機(jī)理同(1)；

(4)反應(yīng)機(jī)理同(2)，通過連接反應(yīng)，使兩個(gè)雙鏈分子中各自的另一條鏈發(fā)生了交換。目前三十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.2.2λ噬菌體DNA的整合與切除

λ噬菌體與宿主的特異重組位點(diǎn)稱附著位點(diǎn)(attachmentsite,att)。λ整合酶(λintegrase,INT)，將兩DNA分子交互切開，然后再交互連接，整合噬菌體DNA。整合宿主因子(integrationhostfactor,IHF)。切除酶（excisionenzyme，XIS）需要將原噬菌休兩側(cè)附著位點(diǎn)聯(lián)結(jié)到一起目前三十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.2.3細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組

鼠傷寒沙門氏桿菌(Sahnunellatyphinnurium)的鞭毛蛋白有兩種，分別為FljC鞭毛蛋白和FljB鞭毛蛋白。同一個(gè)細(xì)菌不會(huì)同時(shí)具有兩種鞭毛蛋白，但從單菌落的沙門氏菌中經(jīng)常能出現(xiàn)少數(shù)呈另一鞭毛蛋白的細(xì)菌細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變。這一轉(zhuǎn)變是由一段995bp的DNA（H片段，Hsegment)發(fā)生倒位引起的。其詳細(xì)機(jī)制將在第11章介紹。

目前三十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)IgG的分子結(jié)構(gòu)6.2.4免疫球蛋白基因的V(D)J重組

免疫球蛋白(Ig)是B淋巴細(xì)胞合成和分泌的，由兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)組成。IgH和IgL的氨基端序列因Ig的抗原結(jié)合特異性不同而變化，稱可變區(qū)(V)，決定Ig抗原結(jié)合特異性。羧基端是恒定區(qū)(C)，具有結(jié)合補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等特性，介導(dǎo)Ig的生物學(xué)功能。

目前三十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098編碼Ig的基因有多個(gè)區(qū)域組成，IgH基因由可變區(qū)(V)，多樣性片段(D)，連接片段(J)，和恒定區(qū)(C)片段組成。其中V,D,J編碼V區(qū)，IgL由V,J,C片段組成。在B細(xì)胞發(fā)育過程中，V,D和J通過重組連在一起，形成Ig的轉(zhuǎn)錄單位。目前四十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

V(D)J重組是B細(xì)胞特有的，決定了Ig表達(dá)的B細(xì)胞特異性。

人類IgH基因大約有51個(gè)V，27個(gè)D和6個(gè)J，可產(chǎn)生8262種組合。Igκ基因有40個(gè)V和5個(gè)J，可形成200種組合，Igλ基因有30個(gè)V和4個(gè)J，可形成120種組合。IgH與IgL的組合可達(dá)8262×(200+120)=2.64×106

種。

因此，免疫球蛋白的V(D)J重組是產(chǎn)生抗體多樣性的主要機(jī)制。目前四十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)目前四十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3轉(zhuǎn)座重組6.3.1轉(zhuǎn)座子的概念

轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)指DNA上的核苷酸序列從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)位置的現(xiàn)象。

發(fā)生轉(zhuǎn)座的DNA片段被稱為轉(zhuǎn)座子(transposons)或可移位的遺傳元件(mobilegeneticelements,MGE)，有時(shí)還被稱為跳躍基因(jumpgene)。

目前四十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)轉(zhuǎn)座子的主要特征有：①能從染色體的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)，或轉(zhuǎn)移到另一個(gè)染色體。②不能像噬菌體或質(zhì)粒那樣獨(dú)立存在。③轉(zhuǎn)座子編碼其自身的轉(zhuǎn)座酶，移動(dòng)時(shí)攜帶轉(zhuǎn)座必需的基因一起躍遷。④轉(zhuǎn)座的頻率很低，且插入是隨機(jī)的，不依賴于轉(zhuǎn)座子(供體)和靶位點(diǎn)(受體)之間的序列同源性。

目前四十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

轉(zhuǎn)座子最初是BarbaraMcClintock于1940年代在玉米的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)稱為控制元件(controllingelement)。1983年McClintock被授予諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前四十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

轉(zhuǎn)座重組的后果：

可引起基因組內(nèi)核苷酸序列發(fā)生轉(zhuǎn)移、缺失、倒位或重復(fù)，從而導(dǎo)致突變，也可能改變基因組DNA的量。

如果轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)基因的內(nèi)部？如果插入一個(gè)基因的上游？

此外，轉(zhuǎn)座子本身還可能充當(dāng)同源重組系統(tǒng)的底物，原因是在1個(gè)基因組內(nèi)，雙拷貝的同一種轉(zhuǎn)座子提供了同源重組所必需的同源序列。

目前四十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

轉(zhuǎn)座子在生物體內(nèi)是普遍存在的，人、小鼠和水稻的基因組有40％左右的序列由轉(zhuǎn)座子衍生而來，但在低等的真核生物和細(xì)菌內(nèi)的比例較小，約占1%～5％。

這說明轉(zhuǎn)座子在生物從低等到高等的基因組進(jìn)化過程中曾發(fā)揮過十分重要的作用。

不少轉(zhuǎn)座子序列與疾病有關(guān)。目前四十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.2原核生物的轉(zhuǎn)座子

原核生物的轉(zhuǎn)座子最早是在E.coli的半乳糖操縱子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，迄今為止，在細(xì)菌內(nèi)已發(fā)現(xiàn)四類轉(zhuǎn)座子。6.3.2.1第一類轉(zhuǎn)座子

第一類轉(zhuǎn)座子是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座元件，能夠從DNA的一個(gè)位點(diǎn)插入到另一個(gè)位點(diǎn)，因此，被稱作插入序列(insertionsequences,IS)。

目前四十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)目前五十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)第一類轉(zhuǎn)座子特點(diǎn)：(1)長度較小，通常在700bp～800bp之間，兩端有10bp～40bp長的反向重復(fù)序列IR。

(2)內(nèi)部一般只有一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因(transposase,tnpA)。轉(zhuǎn)座酶的量受到嚴(yán)格的調(diào)控，它是決定轉(zhuǎn)座頻率的主要因素。

(3)通過剪切和插入的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，經(jīng)過填補(bǔ)缺口和連結(jié)切口，會(huì)增加一個(gè)拷貝的靶位點(diǎn)序列，完成轉(zhuǎn)座后，插入序列兩側(cè)各有一個(gè)靶位點(diǎn)序列，呈正向重復(fù)。目前五十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)IS類別長度(bp)IR長度(bp)靶位點(diǎn)長度(bp)染色體上的拷貝數(shù)F質(zhì)粒上的拷貝數(shù)IS176820/2395～8IS2132732/41551IS3125839/39352IS4142616/1811,12或141或2IS5119515/164豐富IS10R132917/229表6-1

E.coli中常見的插入序列目前五十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.2.2第二類轉(zhuǎn)座子

第二類轉(zhuǎn)座子又稱為復(fù)雜型轉(zhuǎn)座子(complextransposon)，特征為：

長度較大，通常2.5kb～20kb，兩側(cè)含有35bp～40bp的IR序列。

內(nèi)部一般有多個(gè)基因，轉(zhuǎn)座酶，解離酶，抗生素抗性基因(resistancegene)。

轉(zhuǎn)座可導(dǎo)致靶位點(diǎn)重復(fù)。復(fù)雜型轉(zhuǎn)座子的靶序列為5bp，轉(zhuǎn)座導(dǎo)致靶位點(diǎn)序列發(fā)生重復(fù)，結(jié)果在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)形成正向重復(fù)序列。目前五十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)目前五十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)轉(zhuǎn)座子抗性標(biāo)記長度(bp)IR長度(bp)Tnl青霉素4957Tn3青霉素495738Tn501Hg抗性820038Tn7甲氧芐氨嘧啶、壯觀霉素、鏈霉素1400035表6-2幾種第二類轉(zhuǎn)座子的特征目前五十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.2.3第三類轉(zhuǎn)座子第三類轉(zhuǎn)座子又名復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)，由2個(gè)IS和一段帶有抗生素抗性的間插序列組合而成，其中的2個(gè)IS位于轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)，具有相同或相反的方向。目前五十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)表6-3幾種第三類轉(zhuǎn)座子的特征轉(zhuǎn)座子抗性基因長度(bp)插入序列Tn5抗卡那霉素(KanR)5700IS50Tn9抗氯霉素(CmR)2638IS1Tn10抗四環(huán)素(TetR)9300IS10目前五十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.2.4第四類轉(zhuǎn)座子第四類轉(zhuǎn)座子的典型例子是Mu噬菌體(BacteriophageMu)，它是E.coli的一種溫和噬菌體，具有裂解和溶源生長周期。 Mu噬菌體的DNA可以通過轉(zhuǎn)座的方式隨機(jī)整合到宿主DNA中，還可以通過復(fù)制型轉(zhuǎn)座，隨機(jī)插入到宿主DNA的其他區(qū)域，它容易誘發(fā)宿主細(xì)胞的各種突變，因此被稱為突變子(mutator)。

目前五十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)A基因編碼的MuA為轉(zhuǎn)座酶， B基因編碼的MuB為ATP酶 MuB還通過與MuA的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，阻止MuB結(jié)合到已經(jīng)與MuA結(jié)合的DNA區(qū)域的附近，使Mu噬菌體周圍的DNA不易成為Mu轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)，這種現(xiàn)象稱轉(zhuǎn)座目標(biāo)免疫(transpositiontargetimmunity)。目前五十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)目前六十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.3真核生物的轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座是真核生物極為普遍的現(xiàn)象。根據(jù)轉(zhuǎn)座方式可將真核生物的轉(zhuǎn)座子分為兩大類：

以DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子，稱DNA轉(zhuǎn)座子(DNAtransposons)。

以DNA-RNA方式轉(zhuǎn)座的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，稱逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposableelements)。

目前六十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn) DNA轉(zhuǎn)座子可分為3種類型，其共同特點(diǎn)是都具有兩個(gè)末端反向重復(fù)序列。

自主型元件：自身能夠轉(zhuǎn)座

非自主型元件：只有在自主元件存在時(shí)才能轉(zhuǎn)座。自主元件與非自主元件通常以一個(gè)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的形式存在于基因組中。拷貝數(shù)一般較少。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件：MITEs具有IR，不編碼轉(zhuǎn)座酶，為非自主DNA類轉(zhuǎn)座子，其序列小(一般為100～500bp)且拷貝高,具有插入位點(diǎn)偏愛性。MITEs具有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子所具有的高拷貝特點(diǎn)。

目前六十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

目前發(fā)現(xiàn)的自主元件/非自主元件主要隸屬兩個(gè)超家族。

hAT

超家族是Warren等于1994年發(fā)現(xiàn)的3個(gè)該類轉(zhuǎn)座子(hobo、Ac和Tam3)的第1個(gè)字母命名的，包括玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和金魚草的Tam3轉(zhuǎn)座子等。其特征是：①在轉(zhuǎn)座過程中產(chǎn)生8bp的靶位點(diǎn)重復(fù)。②有5～27bp的短反向末端重復(fù)。③大多數(shù)hAT類轉(zhuǎn)座子小于4kb。

CACTA超家族最典型的特征是具有長10～28bp的末端反向重復(fù),其末端是保守的CACTA，是轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)。該類轉(zhuǎn)座子包括玉米的En/Spm轉(zhuǎn)座系統(tǒng)和高粱的Candystripe轉(zhuǎn)座子等，最早發(fā)現(xiàn)CACTA轉(zhuǎn)座子是水稻的Tnr3，是作為插入片段被鑒定出來的，大小為1539bp，并有13bp的反向末端重復(fù)。

目前六十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.3.1玉米的控制因子玉米的激活-解離系統(tǒng)(activator-dissociationsystem,Ac-Ds)是McClintock最先發(fā)現(xiàn)的。 Ac表示激活子元件(activatorelement)，屬于自主型轉(zhuǎn)座子，約有4563bp，兩端是11bp的IR序列，帶有全功能的轉(zhuǎn)座酶基因。 Ds表示解離元件(dissociationelement)，屬于非自主型轉(zhuǎn)座子，兩端也是11bp的IR序列，但中間只有缺失的，無功能的轉(zhuǎn)座酶基因，它實(shí)際上是Ac經(jīng)由不同的缺失突變而來的。有Ac存在時(shí)Ds才會(huì)移座。目前六十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)

玉米種子的顏色由紫色色素基因C決定。如果Ac或Ds插入到C基因內(nèi)部，則紫色色素基因失活，于是玉米籽粒不能產(chǎn)生紫色色素，而成為黃色。Ac和Ds在染色體上的跳動(dòng)十分活躍，若在一粒玉米的發(fā)育過程中，由于體細(xì)胞中Ds的轉(zhuǎn)座，使部分細(xì)胞的C基因中含有Ds，另一部分細(xì)胞的C基因中沒有Ds，玉米籽粒便出現(xiàn)了黃色和藍(lán)色的斑點(diǎn)。目前六十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.3.2果蠅的p因子和雜種不育

p因子是在對(duì)果蠅雜種不育(hybriddysgenesis)的研究中發(fā)現(xiàn)的，是黑腹果蠅的一種自主性轉(zhuǎn)座因子。黑腹果蠅的P品系中含有40～50個(gè)P因子，而M品系則不含p因子。P因子具有31bp反向末端重復(fù)，中間是轉(zhuǎn)座酶。目前六十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)轉(zhuǎn)座酶

p因子的mRNA前體在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中剪接方式不同，體細(xì)胞的剪接保留了第3個(gè)內(nèi)含子。原因是有一種蛋白質(zhì)結(jié)合在第3個(gè)內(nèi)含子上，阻止該內(nèi)含子的剪接。翻譯過程在第3個(gè)內(nèi)含子處中斷，產(chǎn)物是一個(gè)Mr為66000的蛋白質(zhì)，它是轉(zhuǎn)座反應(yīng)的阻遏蛋白。而在生殖細(xì)胞中可以剪接除去包括內(nèi)含子3在內(nèi)的全部?jī)?nèi)含子，翻譯產(chǎn)物是Mr為87000的轉(zhuǎn)座酶。目前六十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)Hybriddysgenesisisasymmetrical;itisinducedbyPmale×Mfemalecrosses,butnotbyMmale×Pfemalecrosses.若M雄性XM雌性，二者均不攜帶P因子，當(dāng)然無P因子轉(zhuǎn)座，不會(huì)造成后代不育。若P雄性或M雄性XP雌性果蠅交配，因P雌性果蠅體細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)座反應(yīng)阻遏蛋白，也不會(huì)造成后代不育。

當(dāng)p雄性XM雌性果蠅交配時(shí)，子代體細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)座反應(yīng)阻遏蛋白，細(xì)胞正常，因而果蠅可以生存。但生殖細(xì)胞則存在p因子和轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座十分活躍。由于轉(zhuǎn)座因子插入新的位點(diǎn)可引起突變，而原來位置失去轉(zhuǎn)座因子也要造成染色體斷裂，造成生殖細(xì)胞發(fā)育不全，因而無生育能力。目前六十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.3.3.3脊椎動(dòng)物的DNA轉(zhuǎn)座子：自學(xué)

目前六十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.4逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過程中需要以RNA為中間體，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程再分散到基因組中的移動(dòng)因子，稱為逆轉(zhuǎn)錄子(retroposon)或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)。在高等生物中，存在很多與逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組相似的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。

目前七十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.4.2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的生物學(xué)意義

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子廣泛分布于真核生物基因組中，對(duì)基因組功能有重要影響。6.4.2.1對(duì)基因表達(dá)的影響

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對(duì)宿主基因表達(dá)的影響與其整合的部位有關(guān)，當(dāng)插入基因的編碼序列和啟動(dòng)子序列時(shí)，即造成基因失活。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子如果插入到基因上游的調(diào)控區(qū)，如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)，則可使鄰近的沉默基因得到表達(dá)。目前七十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.4.2.2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因的重排

分散在真核生物基因組中的大量逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是基因組的不穩(wěn)定因素，它們能引起基因組序列的刪除、擴(kuò)增、倒位、移位及斷裂等重排。目前七十二頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.5轉(zhuǎn)座的分子機(jī)制轉(zhuǎn)座是由轉(zhuǎn)座酶催化的，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)五類轉(zhuǎn)座酶。具有十分相似的催化機(jī)制，完成DNA鏈的斷裂和重新連接。目前七十三頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.5.1非復(fù)制型轉(zhuǎn)座

非復(fù)制型轉(zhuǎn)座(non-replicativetransposition)又被稱作簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座，將轉(zhuǎn)座子從供體剪切下來，再插入到受體的靶位點(diǎn)上去(圖6-24a)。

基本過程如圖6-24b所示。①轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子兩端的特有序列結(jié)合，并使轉(zhuǎn)座子環(huán)化形成末端聯(lián)會(huì)。②轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座子兩端的特有序列各產(chǎn)生一個(gè)單鏈切口，并在受體位點(diǎn)錯(cuò)位切割DNA雙鏈。③連接轉(zhuǎn)座子和受體DNA的末端。④經(jīng)過拆分和修補(bǔ)合成，即可將轉(zhuǎn)座子從供體轉(zhuǎn)移到受體。目前七十四頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.5.2復(fù)制型轉(zhuǎn)座

復(fù)制型轉(zhuǎn)座(replicativetransposition)是將供體的轉(zhuǎn)座元件復(fù)制一份，插入到受體的靶位點(diǎn)。每轉(zhuǎn)座一次，轉(zhuǎn)座元件的拷貝數(shù)就增加一個(gè)。復(fù)制型轉(zhuǎn)座又可分作兩類，一類不需要RNA中間物，另一類需要RNA中間物。目前七十五頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)6.6PolymeraseChainReaction(PCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

目前七十六頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)DefinitionofPCR(概念)？PCRisamoleculartechniquefortheinvitroDNAamplification(核酸體外擴(kuò)增技術(shù)).PCRallowstheproductionoflargequantitiesofaspecificDNAfromaDNAtemplateusingasimpleenzymaticreactionwithoutalivingorganism,suchasE.colioryeast.Previously,amplificationofDNAinvolvedcloningthesegmentsofinterestintovectorsforexpressioninbacteria,andtookweeks.Butnow,withPCRdoneintesttubes,ittakesonlyafewhours.目前七十七頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)KaryBanksMullis

Khorana(kō-r?‘n?),isthefirstpersonwhodescribedthePCRtheory-AmethodusinganenzymaticassaytoreplicateashortDNAtemplatewithprimersinvitro(1971).Mullis:TheinventionofthePCRin1983isgenerallycreditedtoMullis.InrecognitionofhisimprovementofthePCRtechnique,hewonthe1993NobelPrizeinChemistry.PCRInventionHistory（發(fā)明史）目前七十八頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)PCRprinciples(原理)SemiconservativeReplication(半保留復(fù)制)BasepairingprovidesthemechanismforreplicatingDNA（堿基配對(duì)原則提供了ＤＮＡ復(fù)制的機(jī)制）.目前七十九頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)PCRprocedures(PCR循環(huán)三步曲)Step1.Denaturation(變性)94oC30s-1minStep2.Annealing(退火)55-60oC30s-1minStep3.Extension(延伸)72oC30s-1minPCRcycling:25-40ofthese3stepscycling目前八十頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)PCRprocedures(PCR循環(huán)三步曲)Denaturationstep（變性）:94℃for30S-1min.UnwindingDNAdoublehelix.ItcausesmeltingoftheDNAtemplatebydisruptingthehydrogenbonds(氫鍵)betweencomplementarybases,yieldingsingle-strandedDNAmolecules.Annealingstep（退火）:50–65℃for20s–1min.Primersspecifybindtothesingle-strandedDNAtemplate.Thepolymerasebindstotheprimer-templatehybridandbeginsDNAsynthesis.Extension/elongationstep（延伸）：72℃1-2min.TheDNApolymerasesynthesizesanewDNAstrandcomplementarytotheDNAtemplatestrandbyaddingdNTPsin5‘to3’direction.目前八十一頁\總數(shù)八十八頁\編于六點(diǎn)Exponential(geometric)amplification

(以幾何倍數(shù)擴(kuò)