動物寄生蟲病PCR診斷技術(shù)樣本

資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)之處，請聯(lián)系改正或者刪除。動物寄生蟲病PCR診斷技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)技術(shù)是一種既敏感又特異的DNA體外擴(kuò)增方法,它可將一小段目的DNA擴(kuò)增上百萬倍,其擴(kuò)增效率使得該方法可檢測到單個蟲體或僅部分蟲體的微量DNA。經(jīng)過設(shè)計種、株特異的引物,此法只擴(kuò)增出種、株特異的PCR產(chǎn)物,具有很高的特異性。而且PCR技術(shù)的操作過程也相對簡便快捷,無需對病原進(jìn)行分離純化;同時能夠克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾,直接檢測到病原體的DNA,既可用于蟲種、株的鑒別,動物寄生蟲病的臨床診斷,又可用于動物寄生蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查。隨著PCR技術(shù)的不斷完善與發(fā)展,它已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域,具有廣泛的應(yīng)用前景。一、實驗?zāi)康囊笳莆誔CR診斷技術(shù)所涉及實驗的基本原理,全面熟悉PCR診斷技術(shù)的操作過程,其中包括寄生蟲DNA的提取、PCR引物的設(shè)計、PCR條件的優(yōu)化、對目的片斷的擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析、PCR產(chǎn)物的純化等等。二、實驗儀器和材料(一)寄生蟲基因組DNA的提取及純化1.蟲體材料。單個蟲體。2.器具。超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、TGL-16G高速臺式離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量取液器及配套吸頭、微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機(jī)架等。3.試劑。(1)乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)、十二烷基磺酸鈉(Sodiumdodecylsulfate,SDS)、三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tri(Hydroxymethyl)Aminomethane-HCl,Tris-HCl)、氯化鈉、蛋白酶K(25μg/μl)、異丙醇(80%)、雙蒸水、滅菌超純水等。(2)DNA裂解液:500mMNaCl70μl、100mMTris-HCl(pH8.0)30μl、50mMEDTA(pH8.0)150μl、10%SDS30μl。(3)WizardTMDNAClean-Up試劑盒或類似的DNA提取試劑盒。(二)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1．材料。提純的蟲體DNA。2．器具。超凈工作臺、微型高速臺式離心機(jī)、微量取液器(2/20/200/1000μl)、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、4℃/-20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管(200/500/1500μl)、有機(jī)架、一次性手套、透明膠帶、量筒(100ml)、三角瓶(500ml)等。3．試劑。(1)10×PCRBuffer(無Mg2+)、dNTP(2.5mMeach)、ddH2O、MgCl2(25mM)、Primers、ExTaq酶(5U/l)、瓊脂糖、EB(10mg/ml)、Tris堿、硼酸(Boricacid)、去離子水、EDTA(0.5mol/L,pH8.0)、10×載樣緩沖液。(2)0.5×TBE緩沖液:準(zhǔn)確秤取Tris堿5.4g,硼酸2.75g,充分溶解于800ml去離子水中,加10ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),用去離子水定容至1000ml。(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1．材料。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2．器具。TGL-16G高速臺式離心機(jī);三用電熱恒溫水箱;微量取液器(2/20/200/1000μl)、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管(500/1500μl)、有機(jī)架、透明膠帶、一次性注射器、量筒(100ml)、三角瓶(500ml)、手術(shù)刀、保鮮紙等。3．試劑。瓊脂糖;0.5×TBE緩沖液;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒;UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒;異丙醇(80%)等。三、實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)(一)寄生蟲基因組DNA的提取及純化1.實驗原理。應(yīng)根據(jù)研究目的來決定是從單個蟲體還是多個蟲體提取基因組DNA。寄生蟲蟲體的各個部位都能夠作為基因組DNA的抽提材料,如果蟲體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部,以備形態(tài)學(xué)鑒定以驗證其種類。如果蟲體較小(小于1cm),則應(yīng)使用整條蟲體抽取DNA。若蟲體特別細(xì)小(例如幼蟲),可用多條蟲體來提取DNA。為了獲得高含量、高純度的DNA,最好使用新鮮材料。從凍干或50%-70%乙醇保存的寄生蟲材料中也可較容易地提取DNA。寄生蟲DNA的抽提方法有多種,不同種類的寄生蟲蟲體都有其最適合的抽提方法,但各種方法的基本原理都一樣,即先用機(jī)械的方法將蟲體組織破碎,然后加入DNA裂解液和蛋白酶K,充分作用后,蟲體組織中的細(xì)胞膜破裂,蛋白質(zhì)變性,將蟲體基因組DNA釋放到溶液中。在裂解過程中,蟲體細(xì)胞碎片及大部分蛋白質(zhì)會相互纏繞成大型復(fù)合物,后者被DNA裂解液中的SDS包蓋,經(jīng)過離心沉淀,這些復(fù)合物會從溶液中沉淀下來,變性劑也同時被除去,從而就可從上清中回收蟲體基因組DNA溶液。回收后的蟲體基因組DNA液用WizardTMDNA純化試劑盒進(jìn)行純化。純化時,DNA溶液與純化試劑盒中的清洗樹脂混合后,其混合液在經(jīng)過微型柱時DNA會結(jié)合在柱上,而其它雜質(zhì)會經(jīng)過微型柱排出;再用80%異丙醇進(jìn)行沖洗,去除殘余雜質(zhì)。最后,在微型柱中加入預(yù)熱的TE緩沖液或超純水,使結(jié)合在微型柱上的DNA充分溶解,經(jīng)過離心,其洗脫液即為純化的蟲體基因組DNA溶液。2．實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1)蟲體材料的處理(若為新鮮或凍干保存的蟲體,則不需要此步驟)。若蟲體較大,用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲體材料取出,剪取其中部,保存其頭端或尾端部分。用雙蒸水重復(fù)吹打沖洗2次后,再用超純水重復(fù)沖洗2～3次,置于一新的1.5ml的離心管中。若蟲體較小,取一整條蟲體經(jīng)如上洗滌處理。對于雞球蟲,將保存在2.5%重鉻酸鉀溶液的卵囊懸液以×g離心10min,棄重鉻酸鉀溶液。以雙蒸水重懸,同法離心洗滌三次后,用20%次氯酸鈉處理卵囊20min,×g離心沉淀卵囊,用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀,1500×g離心10min,上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水,3000×g離心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗滌一次。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀,然后將其輕輕地加在0.6M無菌蔗糖溶液之上,×g離心5min,取上層卵囊加5倍體積的水,3000×g離心10min,沉淀再用無菌蔗糖溶液漂浮一次,即可得純凈的卵囊,可立即用于裂解以提取DNA。(2)蟲體材料的裂解。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過的微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎,加入280μl的SDS裂解緩沖液,輕輕混勻,再加入20μl(25μg/μl)的蛋白酶K溶液。對于原蟲如雞球蟲、隱孢子蟲,將純化好的卵囊3000rpm/min離心10min,去掉大部分上清后加入與卵囊體積相同的玻璃珠,漩渦震蕩直到有95％卵囊破壁后,即可加入SDS裂解緩沖液及蛋白酶K溶液。混勻后,放于恒溫培養(yǎng)箱中,37℃作用12～48h,其間不時搖動離心管,使蟲體組織裂解充分。(3)蟲體DNA的抽提和純化。首先進(jìn)行蟲體DNA提取,然后按Promega公司試劑盒WizardTMDNAClean-UpSystem使用說明對DNA進(jìn)行純化。方法如下:①取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約20小時的離心管,旋渦震蕩器震蕩混勻,10000rpm離心2min,上清即為蟲體DNA溶液。將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中,加入1ml清洗樹脂(按50～500μl懸液/1ml清洗樹脂的比例),旋渦震蕩混勻。②取一支5ml的一次性注射器,去針頭,拔出注射器內(nèi)芯推液筒,接上WizardTM微型柱。③將DNA-樹脂混合液全部轉(zhuǎn)移到注射器中,用注射器內(nèi)芯推液筒,慢慢地將DNA-樹脂混合液推過微型柱,排出廢液。④將注射器從微型柱上拔出后,拿去注射器內(nèi)芯推液筒,再將注射器套在微型柱上,向注射器內(nèi)加入2ml柱洗溶液(80%的異丙醇),用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液經(jīng)過微型柱,以洗滌DNA-樹脂樣品。⑤拔去注射器,將微型柱套在潔凈的1.5ml離心管上,10000rpm離心20sec,以除去殘留的異丙醇。⑥將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上,在柱中央加入30～50μl預(yù)熱(60～70℃)的超純水或1×TE緩沖液,靜置1min,10000rpm離心20sec。離心管內(nèi)的液體即為DNA溶液?？蓪NA溶液轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?二)寄生蟲DNA的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1.實驗原理。(1)PCR引物設(shè)計。PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計。PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的寡核甘酸片段,使其能有效地與目的片段兩端的序列互補(bǔ)。設(shè)計引物時要遵循以下原則:①長度不能太長,也不能太短,一般在18～25個堿基左右;②G+C含量及Tm值:引物的G+C含量以40%～60%為宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下50%寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度。PCR引物應(yīng)保持合理的G+C含量。含有50%G+C的20個堿基的引物其Tm值約界于56～62℃,這可為有效退火提供足夠的溫度。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多,因此,G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。對于短于20個堿基的引物,Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物,Tm值的計算較為復(fù)雜。由于PCR擴(kuò)增的特異性取決于兩條引物與相應(yīng)模板的結(jié)合,因此,反應(yīng)中退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個Tm值折衷選擇。③堿基的組成盡量隨機(jī),盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在;特別是3’末端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C;④引物內(nèi)部不應(yīng)有互補(bǔ)序列,否則引物自身會折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。這樣二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基達(dá)3個以上,就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。⑤兩個引物之間不能互補(bǔ),特別應(yīng)避免3’末端的互補(bǔ)重疊以防止形成引物二聚體。兩個引物不應(yīng)有4個以上的堿基連續(xù)相同或互補(bǔ);⑥引物的3’末端應(yīng)與目的片段完全相配。這對于獲得好的擴(kuò)增結(jié)果非常重要。如果能確定一個保守氨基酸,可將其密碼子的前2個堿基作為3’末端。⑦引物的5’末端可不與目的片段互補(bǔ),可被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物的5’末端修飾包括:加酶切位點,標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點、引入翻譯起始密碼子、啟動子序列等。所附加的限制性酶切位點應(yīng)是不會在引物以外的DNA上切割的。為了有效地切割限制性酶切位點,在限制性酶識別序列的5’端常需添加2-3個非特異的額外堿基。⑧若是設(shè)計種或株特異性引物,引物與非特異序列的相似性不能超過70%或有連續(xù)8個以上的互補(bǔ)堿基相同。可用DNAstar、MegAlign軟件比較相似性,用Oligo50來設(shè)計引物。(2)PCR的基本原理。在存在DNA模板、引物、dNTP、適當(dāng)緩沖液(Mg2+)的反應(yīng)混合物中,在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下,對一對寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是經(jīng)過模板DNA、引物之間的變性,退火(復(fù)性),延伸三步反應(yīng)為一周期(cycle),循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA片段得以擴(kuò)增。由于每一周期所產(chǎn)生的DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板,故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加,經(jīng)30個周期后,特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍。在實際應(yīng)用中,一般多用30～35個循環(huán)。(3)瓊脂糖電泳的基本原理。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子,于沸水中溶解,45℃開始形成多孔性濾孔,凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷,在外加電場的作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時,有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA,其分子量大小及構(gòu)型不同,電泳時的泳動率就不同,從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA,主要是利用分子篩效應(yīng),遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠(EB)為扁平狀分子,在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物,其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上,且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。2.實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1)PCR擴(kuò)增。先按單倍擴(kuò)增體系中各試劑的量計算好n倍(除去模板DNA量)擴(kuò)增體系中各試劑相對應(yīng)的量,然后在適合體積的離心管中依次加入試劑(如n×2.5μl10×PCRBuffer、n×2μldNTP,n×4μlMgCl2、n×0.5μlForwardprimer、n×0.5μlReverseprimer、n×14.4μlddH2O、n×0.125μlExTaq酶,最后總體積為n×24μl),經(jīng)離心混勻后,分裝至n個200μl的離心管中(包括陰陽性對照),在各管中加入模板DNA(如擴(kuò)增體系為25μl,則加入1μl模板DNA),混勻后于PCR擴(kuò)增儀中按已設(shè)好的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。如細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基(cytochromecoxidasesubunit1,cox1)基因的擴(kuò)增體系為: 試劑 體積(μl) ddH2O 14.375 10xPCRBuffer 2.5 MgCl2(25mM) 4.0 dNTPs(2.5mMeach) 2 Forwardprimer(100pmol/l,JB3) 0.5 Reverseprimer(100pmol/l,JB4.5) 0.5 ExTaq(5U/l) 0.125 模板(gDNA) 1____________________________________________________ 總量 25coxI基因的PCR擴(kuò)增條件:94℃變性5min94℃變性30s55℃復(fù)性30s30個循環(huán)72℃延伸30s72℃延伸5min擴(kuò)增完畢后,取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃/-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)瓊脂糖凝膠電泳。①制備凝膠:膠濃度視具體情況而定。以配制0.8%瓊脂糖凝膠為例,準(zhǔn)確稱取0.8g瓊脂糖加入至100ml0.5×TBE電泳緩沖液,于微波爐中或經(jīng)高壓熔化均勻,冷卻至50℃左右,加入溴化乙錠(EB)(10mg/ml,加入量為8.3μlEB/100ml瓊脂糖凝膠液),混勻后倒入已封好的凝膠灌制膠模中,插上樣品梳。待膠凝固后,從膠模上除去封帶,拔出梳子放入電泳槽中,加入足夠量的電泳緩沖液(要求緩沖液液面高出凝膠表面約1mm)。②點樣:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3～5μl,與適量的加樣緩沖液(Loadingbuffer,LB))混勻(若為6XLB,3-5μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1μl6XLB),然后用取液器將樣品加入點樣孔中,同時設(shè)以適宜的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(marker)作為參照。③電泳:接通電極,使DNA向陽極移動,在1～10V/cm凝膠的電壓下(常見100V)進(jìn)行電泳。當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段的距離時,關(guān)閉電源。④結(jié)果觀察:將電泳好的瓊脂糖膠置于紫外透射儀中,打開紫外燈,若看到橙紅色的核酸條帶,則說明有擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;根據(jù)條帶粗細(xì),可粗略估計該條帶的DNA量;根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對照,經(jīng)過線性DNA條帶的相對位置可初步估計擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。如果僅出現(xiàn)預(yù)期分子量大小的條帶而無非特異性條帶,則說明擴(kuò)增的特異性較好。如果擴(kuò)增結(jié)果比較滿意,則用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影,保存圖像。(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1.實驗原理。為驗證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的種或株特異性,往往需對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證。為了建立種、株特異的PCR診斷技術(shù),需要確定種、株特異的遺傳標(biāo)記。在這樣的情況下,往往需要將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,連接到克隆載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,然后經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性菌落進(jìn)行測序。獲得純度高的PCR產(chǎn)物是進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測序的前提條件。PCR產(chǎn)物的純化方法一般有兩種:一種是切膠回收,另一種是PCR產(chǎn)物直接回收。切膠回收的原理就是經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,將要回收的目的片段從凝膠上切下來,然后再經(jīng)過DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化,以去除DNA樣品中除了目的基因片段外的所有雜質(zhì)。而PCR產(chǎn)物直接回收法則是將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。兩種方法各有利弊,切膠純化的純度較高,但回收率低;PCR產(chǎn)物直接純化,回收率高,但純度較低。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物很特異,且引物長度小于60bp,則兩種方法都可選用,但如果有非特異性條帶或引物長度大于60bp時,就必須用切膠純化的方法。2.實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1)切膠純化法(按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-5柱式DNA膠回收試劑盒說明進(jìn)行):①取40~50μ1PCR產(chǎn)物于0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳約40~50min(可適當(dāng)縮短電泳時間以提高回收效率)。注意:必須將電泳槽用自來水充分沖洗,電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的,以保證不會有其它DNA污染。②于紫外透射儀中鋪上一塊新鮮的保鮮紙,將凝膠放在保鮮紙上(以盡量提高DNA回收的純度),打開長波紫外燈用干凈的手術(shù)刀快速將目的片段從瓊脂糖凝膠上切下來(盡可能去除多余的瓊脂糖膠)。切下來的膠塊放入一新鮮、滅菌的1.5ml的離心管中,用電子天平稱重并作好記錄。③按每100mg瓊脂糖凝膠或100μl的DNA溶液加入400μlBindingbuffer的量來計算,加入相應(yīng)體積的Bindingbuffer,混勻后置于50~60℃水浴中10分鐘,使膠徹底融化(加熱融膠時,每2分鐘混勻一次)。④將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中,室溫放置2min,用臺式離心機(jī)高速(8000rpm)離心1min。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。⑤取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的廢液,將UNIQ-10柱放回收集管中,加入500μlWashsolution,高速離心(10000rpm)30sec。⑥重復(fù)步驟”⑤”一次。⑦取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的廢液,將UNIQ-10柱放回收集管中,高速離心(10000rpm)1min。⑧將UNIQ-10柱放入一新鮮潔凈的1.5ml離心管中,在柱膜中央加30μlElutionBuffer或雙蒸水(pH＞7.0)到UNIQ-10柱中,室溫或37℃放置2min。(提高洗脫溫度至55-80℃有利于提高DNA的洗脫效率)⑨10000rpm高速離心1min,離心管中的液體即為回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆?。⑩?~5μlPCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合,瓊脂糖電泳檢查回收率,可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。(2)PCR產(chǎn)物直接純化法(按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-5柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明進(jìn)行):①取PCR產(chǎn)物40~50μl,加入3倍體積的Bindingbuffer,混勻。②把混合液轉(zhuǎn)移到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中,室溫放置2min,用臺式離心機(jī)高速(8000rpm)離心1min。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。③倒掉收集管中的廢液,將UNIQ-10柱放入同一收集管中,加入500μlWashsolution,高速離心(10000rpm)30sec。④重復(fù)”③”步驟一次。⑤倒掉收集管中的廢液,將UNIQ-10柱放回收集管中,高速離心(10000rpm)1min。⑥將UNIQ-10柱放入一根新鮮潔凈的1.5ml離心管中,在柱膜中央加入30μlElutionBuffer或雙蒸水(pH＞7.0)到UNIQ-10柱中,室溫或37℃放置2min(提高洗脫溫度至55-80℃有利于提高DNA的洗脫效率)。⑦10000rpm高速離心1min,離心管中的液體即為回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆?。⑧?~10μlPCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合,電泳檢查回收率,可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。(六)動物寄生蟲病特異PCR診斷技術(shù)實例以檢測雞柔嫩艾美爾球蟲感染為例,選用Fernandez等()報道的柔嫩艾美爾球蟲種特異的引物(Tn-01-F:5’-CCGCCCAAACCAGGTGTCACG-3’;Tn-01-R:5’-CCGCCCAAACATGCAAGATGGC-3’),建立特異、敏感、快速的特異PCR診斷技術(shù),用于雞柔嫩艾美爾球蟲感染的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。1．PCR反應(yīng)。按常規(guī)方法進(jìn)行,在0.2mlPCR管配制反應(yīng)液,總體積為25μL,其中: 試劑 體積(μl) 10xPCRBuffer 2.5 MgCl2(25mM) 2.5 dNTPs(2.5mMeach) 2 Forwardprimer(Tn-01-F,50pmol/μl) 0.275 Reverseprimer(Tn-01-R,50pmol/μl) 0.275 ddH2O 16.2 rTaq(5U/μl) 0.25 _________________________________________________ 模板(gDNA) 1同時設(shè)陽性對照和空白對照。2．反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為:96℃預(yù)變性5min,然后94℃變性1min、65℃退火2min,共30個循環(huán),最后72℃后延伸7min。3.結(jié)果判定。PCR產(chǎn)物在1.0%TBE瓊脂糖凝膠電泳,用溴化乙錠染色,紫外投射儀下觀察結(jié)果。陽性對照可見分子量大小約530bp的條帶;臨床樣品如有同樣大小條帶判為陽性;陰性對照不見擴(kuò)增條帶。四、實驗注意事項(一)寄生蟲基因組DNA的提取及純化1．操作中所使用的鑷子和剪刀一定要事先滅菌并于超凈工作臺中紫外照射1~1.5h,以保證沒有污染其它DNA。2．吸取上清液