人類提取核酸內(nèi)切酶切割瓊脂糖凝膠電泳

人類提取核酸內(nèi)切酶切割瓊脂糖凝膠電泳第一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理和方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用第二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取原理哺乳動物的一切有核細胞都可以用來制備DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時（如羊水細胞），還必須經(jīng)過細胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細胞；有時為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細胞、發(fā)根細胞。第三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取原理根據(jù)材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞，保持DNA分子的完整；（3）將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈。第四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取原理一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。這一方法獲得DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實驗第五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取一、材料

一份提取總DNA的細胞或組織1.5ml

Eppendorf管、微量移液器與吸頭、15ml離心管、三角瓶（500或1000ml）。二、設(shè)備離心機、電子天平、恒溫水浴箱、紫外分光光度計、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、微波爐或沸水浴、透射紫外燈。

第六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取三、試劑1．細胞核裂解液(STE)：0.1

mol/L

NaCl，10mmol/L

Tris-HCl，1mmol/L

EDTA

2．0.8%（W/V）標準瓊脂糖；3．0.5×TBE緩沖液4．其他試劑：TE緩沖液或重蒸水、氯仿/異戊醇（24:1，V/V）、異丙醇或無水乙醇、電泳加樣緩沖液、溴化乙錠（EB）第七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取DNA的提取

1.

采集口腔粘膜脫落細胞，用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，用分泌出的唾液反復漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清；重復1次。

2.沉淀中加1ml

1×細胞核裂解液(STE)，混勻，再加350μl

STE和150μl

10%

SDS，搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。加10μll20mg/ml蛋白酶K，搖勻。37℃溫箱過夜或50℃3~4小時。第八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取

3．加等體積飽和酚，輕搖混勻10分鐘，2000rpm離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4.小心移上清至另一離心管，加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫2000rpm離心5分鐘。

5.小心移上清，若上清不清亮透明，則用等體積氯仿再抽提一次。第九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取6.將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100μl

TE中，測OD值。

7.

TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求長期保存，則需加2倍體積無水乙醇置-70℃保存。第十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取

1.酚抽提時如果上清液太黏，不能和蛋白質(zhì)分開時，可加入適量STE稀釋，然后再用酚抽提。

2.保溫可在45~55℃范圍內(nèi)進行。

3.真核生物的DNA分子很大，機械張力極易引起DNA分子的斷裂，因此抽提DNA時動作不可過猛；溶液轉(zhuǎn)移次數(shù)要盡量減少，而且轉(zhuǎn)移時一定要用粗口徑滴管，以防機械力（震動）將DNA分子打得太碎。注意事項

第十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類基因組DNA提取4.沉淀DNA時要小心操作，勿使纖維網(wǎng)斷成小絲。

5.DNA溶于TE溶液時可先濃一點，發(fā)現(xiàn)太濃時再加些TE溶液。這樣能保證DNA樣品不至于太稀而無法使用，一般來講，DNA濃度為0.4~0.6mg/ml最為理想。

6.溶于TE溶液中的DNA樣品比較穩(wěn)定，可在4℃冰箱中存放1年而不會降解第十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶：是識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶的分類：根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu),輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type

I）、第二型（Type

II）及第三型（Type

III）

第十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶第一型限制酶不能準確定位切割位點，所以并不常用。第二型限制酶所剪切的堿基序列通常即為所認知的回文序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類第三型限制酶不能準確定位切割位點，所以并不常用

第十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶來源：主要是從原核生物中分離純化的。化學本質(zhì):化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)。

作用：催化作用，切割的化學鍵為磷酸二酯鍵。

作用特點：特異性第十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶

切割方式：錯位切--產(chǎn)生兩個相同的黏性末端，如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5ˊ黏性末端。

5’GAATTC3’3’CTTAAG5’

AATTC3’G5’

5’G3’CTTAA第十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶

切割方式：平切--形成平末端。如SmaⅠ。5?-CCCGGG-3?5?-CCCGGG-3?3?-GGGCCC-5?3?-GGGCCC-5?第十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用膠床準備靜置鋪膠凝膠準備膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣電泳取出凝膠拍照第十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用第十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用瓊脂糖凝膠電泳主要是應用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。

與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。第二十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用（1）.適合分離大片段DNA。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb（千堿基）,利用脈沖電泳，可分離高達107bp的DNA片段第二十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用（2）可提取大分子DNA利用瓊脂糖凝膠制成凝膠塊提取基因組DNA能夠獲得足夠大的DNA片段，可以完全符合構(gòu)建粘粒基因組文庫的要求。第二十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

人類細胞質(zhì)RNA提取RT-PCR的原理、方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應用第二十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取真核細胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細胞質(zhì)中。第二十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應的蛋白產(chǎn)物第二十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取分離高質(zhì)量RNARNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性。第二十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提?。?）常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。第二十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。第二十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。第二十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提?。?）RNA提取的一般步驟RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA第三十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取1.破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織加入β-ME可以抑制RNA酶活性2.分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。第三十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取3.沉淀RNA一般用乙醇、3mol/LNaAc（pH-5.2）或異丙醇。4.洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。第三十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取5.融解RNA一般使用TE。6.保存RNA應該盡量低溫。為了防止RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存也應該如此。第三十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五人類細胞質(zhì)RNA提取所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。第三十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五RT-PCRRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。第三十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五RT-PCRPCR基本步驟：A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。以上三步為一個循環(huán)，如此反復。第三十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR基本過程由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，