提高白色鏈霉菌鹽霉素產(chǎn)量的工藝研究

提高白色鏈霉菌鹽霉素產(chǎn)量的工藝研究【摘要】以白色鏈霉菌SLF2110為產(chǎn)生菌，著重從菌種選育和補料工藝兩方面研究提高白色鏈霉菌的鹽霉素產(chǎn)量。結(jié)果表明，①氯化鋰前處理與紫外線復(fù)合處理后篩選出的突變株鹽霉素發(fā)酵產(chǎn)量有很大提高；②在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中減少豆油加量，采用中間補豆油控制，發(fā)酵水平與沒有補料的相比有較大提高。

【關(guān)鍵詞】鹽霉素；白色鏈霉菌；發(fā)酵工藝

Studyontheimprovementoffermentationprocessforyieldofsalinomycin

ABSTRACTThestudyreferstotheimprovementoffermentationprocessforincreasingtheyieldofsalinomycin.UsingStreptomycesalbusSLF2110astheproducingstrain,theyieldofthefermentationcanbeincreasedlargelywiththemethodofmutagenesisinducedbyUVandLiClandtheoptimizationofthebeanoilfeedingforsalinomycinfermentationprocess.

KEYWORDSSalinomycin;Streptomycesalbus;Fermentationprocess

鹽霉素(salinomycin)是從白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)的深層培養(yǎng)液中分離得到的一種聚醚類抗生素，由6分子乙酸，6分子丙酸和3分子丁酸提供的相應(yīng)酰基縮合而成［1～2］。日本于1979年批準鹽霉素用作球蟲病防治劑，1987年歐共體批準鹽霉素用作抗球蟲劑和促生長劑，1993年我國部正式批準其作同樣的用途。鹽霉素作為禽用抗球蟲劑在世界范圍內(nèi)得到普及，前景將十分廣泛。

抗生素發(fā)酵水平的提高，主要取決于菌種改良和培養(yǎng)工藝優(yōu)化［3］。為提高白色鏈霉菌中鹽霉素產(chǎn)量，在過去的基礎(chǔ)上［4～7］，我們從菌種選育和補料工藝兩方面進行研究，以期提高鹽霉素的生產(chǎn)水平。

1材料與方法

菌種

供試菌株為白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)SLF2110。

培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基。

搖瓶培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏5，酵母粉3，氯化鉀2，丙三醇20，消泡劑1。

種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖15，黃豆粉20，小麥胚芽10，碳酸鈣3，牛肉膏5，酵母粉3，氯化鉀2，丙三醇20，KH2PO41，消泡劑1?！?。

發(fā)酵培養(yǎng)基1(不補料工藝)(g/L)硫酸銨5，黃豆粉30，豆油85，KH2PO41，MgSO4，碳酸鈣5，食鹽3，消沫劑1。～。

發(fā)酵培養(yǎng)基2(補豆油工藝)(g/L)硫酸銨5，黃豆粉30，豆油50，KH2PO41，MgSO4，碳酸鈣5，食鹽3，消沫劑1?！?。

效價測定培養(yǎng)基(%)蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，瓊脂粉。～。

實驗規(guī)模

搖瓶種子250ml三角瓶內(nèi)裝25ml培養(yǎng)基，接入成熟斜面孢子，33℃于搖床培養(yǎng)70h左右，轉(zhuǎn)速220r/min。

種子培養(yǎng)20L種子罐裝12L培養(yǎng)基，接入搖瓶種子，接種量120ml，罐溫35℃，罐壓，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，通氣比為1∶，培養(yǎng)30h左右。

發(fā)酵培養(yǎng)50L發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基30L，從種子罐取種3L接入，罐溫33℃，罐壓，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，通氣比為1∶，中途采用補加豆油工藝與不補料工藝兩種方式，12d放罐，測定放罐液效價。

測定方法

還原糖測定斐林試劑法。

氨基氮測定甲醛法。

鹽霉素效價測定以杯碟法測定，檢定菌為短小芽孢桿菌。

豆油和脂肪酸的測定按文獻［8］進行。

脂肪酶活力的測定37℃下，將1ml發(fā)酵液每分鐘分解底物產(chǎn)生1μmo1脂肪酸定義為一個酶活單位。

菌絲濃度的測定10ml發(fā)酵液于離心管內(nèi)3000r/min離心10min，測量上清液體積，計算得出：

菌絲濃度(%)=(10-上清液體積)÷10×100%

誘變方法

(1)懸浮液制備將生產(chǎn)用SLF2110孢子斜面，加蒸餾水l0ml，制成孢子懸液，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，置旋轉(zhuǎn)搖床振蕩15min，然后用濾紙過濾，使成單孢子懸液，供誘變處理用。

(2)氯化鋰處理選用%、%、%三種濃度進行處理。氯化鋰與培養(yǎng)基按上述比例混合后置平皿培養(yǎng)3～5d，觀察敏感度，10d觀察菌落形態(tài)，過篩后進行搖瓶發(fā)酵試驗，比較突變株與對照株的效價。

(3)氯化鋰與紫外線復(fù)合處理

氯化鋰前處理制成%氯化鋰的單孢子懸浮液，28℃振蕩4h，取5ml于無菌平面皿中，置波長253nm、功率30w的紫外燈下30cm處，磁力攪拌照射一定時間，立即稀釋分離于平皿。

氯化鋰后處理單孢子懸浮液，在搖床上振蕩培養(yǎng)4h，取5ml于無菌平面皿中，置波長253nm、功率為30w的紫外燈下30cm處，磁力攪拌照射一定時間進行分離于含%氯化鋰的上層培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

自然分離

供試菌株SLF2110的單孢子懸液，經(jīng)自然分離，從中獲得一株新菌株lNSLF2110作為出發(fā)菌株，效價49118u/ml，較SLF2110提高18%(41588u/ml)。

氯化鋰處理

(1)氯化鋰敏感度以lNSLF2110為出發(fā)菌株，用不同劑量的氯化鋰處理，其敏感度結(jié)果見表1。

(2)突變菌株的菌落形態(tài)以lNSLF2110為出發(fā)菌株，經(jīng)氯化鋰處理后培養(yǎng)，形成的菌落形態(tài)有3種類型，3種菌落類型的菌株中分別挑出代表性菌株進行斜面培養(yǎng)，過篩，觀察誘變后的變異率。其中圓帽狀型(類型Ⅲ)的正變率為最高。結(jié)果見表2。

(3)氯化鋰與紫外線復(fù)合處理以lNSLF2110為出發(fā)菌株，分別采用①氯化鋰前處理與紫外線復(fù)合處理和②氯化鋰后處理與紫外線復(fù)合處理，考察其誘變效應(yīng)，同時以不經(jīng)過誘變處理的各稀釋濃度的單孢子懸浮液涂于空白平板作為對照，結(jié)果見表3。

表3結(jié)果表明，先用氯化鋰前處理后再與紫外線復(fù)合處理對菌株的誘變效應(yīng)較氯化鋰后處理更好，正

表1不同劑量氯化鋰對出發(fā)菌株的敏感度略

表2三種典型菌落的菌株誘變后的變異率情況略

表3氯化鋰與紫外線復(fù)合處理的誘變效應(yīng)略

(4)篩選結(jié)果比較以lNSLF2110為出發(fā)菌株，經(jīng)單一的氯化鋰處理后篩選出的正變率高氯Ⅳ突變株和經(jīng)氯化鋰前處理與紫外線復(fù)合處理后篩選出的正變率高氯UVⅩ突變株，與1NSLF2110菌株進行對比試驗，篩選結(jié)果見表4。結(jié)果表明，經(jīng)氯化鋰前處理與紫外線復(fù)合處理后篩選出的突變株氯UVⅩ發(fā)酵水平最高，比原出發(fā)菌株提高54%，脂肪酶的活力比原出發(fā)菌株提高近兩倍。

補豆油工藝

鹽霉素的合成途徑為聚多酮途徑，起始單位是三碳單位丙二酰CoA。以植物油或動物油作為培養(yǎng)基碳源能提供

(1)氯化鋰或紫外線復(fù)合氯化鋰方式來誘變育種是篩選獲得鹽霉素高產(chǎn)菌株的有效手段。本研究通過氯化鋰和紫外線復(fù)合氯化鋰誘變成功，獲得高產(chǎn)菌株具有較高的脂肪酶活力，比原出發(fā)菌株的脂肪酶活力提高近兩倍，鹽霉素增產(chǎn)達50%以上。

(2)比色測定發(fā)酵液中豆油、游離脂肪酸質(zhì)量分數(shù)，間接計算出脂肪酶的活力，不僅可以知道不同發(fā)酵階段菌體對豆油的分解能力，而且知道殘油量及脂肪酸的利用情況?？疾彀l(fā)酵過程中脂肪酶活力的動態(tài)變化，可作為控制發(fā)酵的一個參數(shù)。實驗證明脂肪酶是由

表4氯Ⅳ、氯UVⅩ突變株與1NSLF2110菌株搖瓶效價比較(略)

表5補豆油工藝與不補料工藝結(jié)果比較略

(3)鹽霉素發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的脂肪酶將豆油分解成甘油和脂肪酸，通過測定發(fā)酵液中的脂肪酸和豆油濃度，可以計算出脂肪酶活力，用于優(yōu)化鹽霉素發(fā)酵的補油工藝。

(4)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中減少豆油加量，采用發(fā)酵中途分階段補豆油方式可提高鹽霉素發(fā)酵水平%。該補料工藝的發(fā)酵結(jié)果重現(xiàn)性很好，為今后工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的。但是豆油補加時機和補加量是否合理，對鹽霉素發(fā)酵水平有重要影響，需要進一步深入的研究。

【參考文獻】

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