高效液相色譜知識(shí)

第二十章高效液相色譜法highperformanceliquidchromatography；HPLC分析化學(xué)教研室李發(fā)美教授1經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高壓輸送流動(dòng)相，高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，現(xiàn)代液相色譜分析方法。

2與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)109g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1012g。

3與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。

4第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型 四類基本類型色譜法

分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）5第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型 四類基本類型色譜法

分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法6

其他色譜類型親合色譜法（affinitychromatography；AC）手性色譜法（chiralchromatography；CC）膠束色譜法（micellarchromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）7二、化學(xué)鍵合相色譜法

以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相

8優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法：根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱9（一）正相鍵合相色譜法

固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì)10正相鍵合相色譜法分離機(jī)制？分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用分離選擇性：極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。11（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑常用甲醇－水、乙腈－水等應(yīng)用：最廣。非極性至中等極性的組分，（還有有機(jī)酸、堿及鹽等）

12保留機(jī)制疏溶劑理論（solvophobictheory）溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力，13反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）

極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。2、固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長(zhǎng)而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。

14反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素3、流動(dòng)相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大pH：影響弱酸、弱減的離解 流動(dòng)相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。15離子哪抑制防色譜似法（io曬n糧su失pp齊re宜ss呆io嫩n頌ch賺ro幕ma奸to寸gr饑ap揀hy；IS擇C）用少宮量弱倍酸、沸弱堿減或緩諸沖溶誓液，芽調(diào)節(jié)獻(xiàn)流動(dòng)惠相的pH，抑制餓有機(jī)針弱酸夠、弱岸堿的至離解剝，增蘭加疏絹水締森合作然用，吼使k變大榮。適用甲于3≤稀pKa≤不7的弱曬酸、7≤束pKa≤顆8的弱志堿反相捏鍵合邀相色顧譜法16把離咸子對(duì)橡試劑玩加入曾到含故水流吹動(dòng)相征中，遮組分悉離子筐在流鮮動(dòng)相狼中與嬌離子娘對(duì)試雪劑的散反離芝子（co編un悄te爐r痛io永n）生成中性梨離子援對(duì)，增嶼加溶拐質(zhì)與惕非極凝性固示定相己的作叔用，海使k增加舟，改決善分盛離效稻果。（三切）反看相離訊子對(duì)勉色譜奮法pa競(jìng)ir數(shù)ed渴i燒onch狹ro蘭ma四to抽gr峰ap蹦hy；PI忍C僻io萬n喘pa擠ir袍c購(gòu)hr蟲om代at緊og姻ra嘉ph圾y；IP哀C17反相宋離子丑對(duì)色殺譜法離子攔對(duì)?；?3++()+3s3(+固定寨相+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對(duì)mB+ABAmA(s流動(dòng)產(chǎn)相通式18影響訴容量擦因子危的因井素離子厭對(duì)試禁劑的筋種類販和濃衛(wèi)度：宏碳鏈太長(zhǎng)度傻增加昏，溶粉質(zhì)的k增大鐮；在閉一定阿范圍炭?jī)?nèi)試桐劑的袍濃度餅升高功，溶上質(zhì)的k增大流動(dòng)津相的pH：有利鳳于組合分和挖離子議對(duì)試睛劑離憤子化濟(jì)時(shí)（殘離子擊對(duì)的畜形成嘩），誕組分兩的k值最嬸大固定淡相統(tǒng)、流獎(jiǎng)動(dòng)相釋性質(zhì)緣瑞（同轉(zhuǎn)一般RP感-H沾PL峰C）。19適用綁范圍弊：有速機(jī)酸墊、堿閣、鹽注，離慢子型濾和非押離子通型化賽合物掉的混顛合物距。分析鄭酸類頌或帶帝負(fù)電歇荷物躺質(zhì)：迅用季器銨鹽侮，如故四丁蜻基銨攤磷酸價(jià)鹽（TB注A）和溴油化十姐六烷剪基三陰甲基雹銨（CT立AB）等分析摩堿類浸或帶耐正電怕荷的光物質(zhì)做：用簽烷基癢磺酸莊鹽或焰硫酸剖鹽，患如正棵戊烷旅基磺致酸鈉盡（PI取CB5）、正己做烷基壁磺酸嘉鈉（PI毀CB6）、適用壤范圍終和離領(lǐng)子對(duì)傍試劑旋的選休擇20第二緩節(jié)喬高效銹液相桶色譜雨法的邁固定教相和巷流動(dòng)蒜相及復(fù)其選閃擇固定蓄相應(yīng)部符合雕下列嫁要求訪：顆粒混細(xì)且糠均勻誕；傳質(zhì)柿快；機(jī)械挽強(qiáng)度擱高，梅能耐榜高壓果；化學(xué)逗穩(wěn)定維性好斑，不蜂與流賢動(dòng)相耽發(fā)生韻化學(xué)真反應(yīng)紗。21一、梳化學(xué)錄鍵合幼相色天譜法煮的固惕定相（一足）鍵巾合相鉗的種賊類非極卡性鍵僚合相六：非極視性烴帳基，勒如C18﹑C8﹑C1與苯扶基等濤鍵合頁(yè)在硅隱膠表吳面；用于用反相寶色譜喇；長(zhǎng)鏈堵烷基鋤可使固溶質(zhì)矛的k增大舒，選連擇性味改善擁，載梅樣量里提高蒼，穩(wěn)苦定性花更好督。22鍵合泰相的壓種類弱極雙性鍵膨合相怨：醚基猴和二干羥基園等鍵部合相用于馬反相廣或正喚相色辦譜極性編鍵合墊相：常用嫂氨基﹑氰基洲鍵合曬相（恩氰乙樹硅烷汗基≡Si臉(C抹H2)2CN占)鍵合典硅膠一般譯用于肌正相納色譜特殊僻用途規(guī)的鍵事合相23（二墾）鍵昆合相戚的性越質(zhì)和迎特點(diǎn)鍵合幣反應(yīng)硅氧肝烷（Si－O－Si－C）型：久氯硅跳烷與留硅膠王進(jìn)行硅烷漂化反剝應(yīng)如：YW挖G－C18H37，無定繡形硅冬膠YW襯G上鍵亦合了十八難硅烷妹基；Sp羞h(yuǎn)e漫ri男so才rbOD漢S，球形綱硅膠Sp僻he束ri武so璃rb上鍵葡合了OD續(xù)S。24鍵合診相的健性質(zhì)餅和特稱點(diǎn)鍵合佳相的敞性質(zhì)含碳貴量：?jiǎn)岷己蔚陌傧》謹(jǐn)?shù)覆蓋演度抬：已窯反應(yīng)閥的硅陣醇基催數(shù)目久占硅忽膠表需面硅羅醇基終總數(shù)忽的比南例封尾租（en克d-窗ca逢pp續(xù)in償g）：在鍵汪合反略應(yīng)后果，用饑三甲議基氯忙硅烷駛等進(jìn)設(shè)行鈍蜓化處鋼理，返減少住殘余肢硅醇挪基。25鍵合準(zhǔn)相的話特點(diǎn)使用愧過程到中不理流失纖；化學(xué)唉穩(wěn)定航性好初；適于那梯度公洗脫夜；載樣娃量大注意單：流動(dòng)澆相的pH一般刺應(yīng)在3-看8，否驢則會(huì)啟引起除硅膠章溶解牛；(也有怨適用鼻寬pH范圍練的鍵匙合相)。鍵合滴相的貧性質(zhì)介和特爺點(diǎn)26二、己化學(xué)背鍵合堂相色摔譜法汁的流域動(dòng)相對(duì)流尿動(dòng)相晨的要免求：與固全定相戰(zhàn)不發(fā)肺生化包學(xué)反耐應(yīng)。對(duì)試屋樣有棄適宜墊的溶鵲解度帝。使k在1~匙10范圍象內(nèi)，與檢具測(cè)器喉相適鞋應(yīng)。脅例如跌用紫徹外檢盛測(cè)器敞時(shí)，唉選用知截止大波長(zhǎng)蔬小于篇檢測(cè)赤波長(zhǎng)近的溶喬劑。純度著高，巧粘度娘小。惹低粘編度流態(tài)動(dòng)相洗如甲朱醇﹑乙腈衣等可饑以降哄低柱吧壓，符提高系柱效賺。27（一溪）流添動(dòng)相今對(duì)分職離的爐影響n由色燙譜柱浩（固翅定相撞）性舌能決歐定，α主要盒受溶娘劑種喬類的約影響簡(jiǎn)，k受溶早劑配鑰比的乞影響投。28（二）遣流動(dòng)糖相的暫強(qiáng)度代和選箏擇性溶劑緩的極漠性（成強(qiáng)度陷）正相濃色譜臟：溶皇劑極爆性越申強(qiáng)，誰(shuí)洗脫寺能力吩越強(qiáng)反相邀色譜基：極鐘性弱壓的溶敏劑洗錦脫能凍力強(qiáng)溶劑慰的選掛擇性不同辮種類灑的溶止劑，兇分子柱間的澤作用騰力不慘同，尸故選疤擇性億不同混合計(jì)溶劑于（二雅元或明多元鴿流動(dòng)爪相）29三、撈分離毀條件剪的選耍擇（一）HP勾LC中的擠速率設(shè)理論渦流沫擴(kuò)散A=2λdp球形艱、小質(zhì)粒度馬、均抖勻（RS適D＜5%）固定頭相，禮勻漿兆高壓往填充需，以自降低A?？v向配擴(kuò)散β=2γDm可以妄忽略久。因?yàn)镈l很小坦，室舟溫操篇作，龍且U大于U最佳，30HP遇LC中的名速率否理論傳質(zhì)璃阻抗固定懶相傳融質(zhì)阻疫抗CS可以煤忽略柔，異因df極小流動(dòng)垂相傳移質(zhì)阻舟抗Cm要求別：dp小，Dm大31靜態(tài)城流動(dòng)燃相傳往質(zhì)阻壓抗止：由于東部分區(qū)流動(dòng)呼相在嬌固定依相微撿孔內(nèi)槐的滯屆留靜態(tài)遠(yuǎn)流動(dòng)植相傳屯質(zhì)阻顏抗系管數(shù)CsmCsm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η要求:固定句相dp2、流動(dòng)遞相η都小HP妄LC中的凱速率輪理論32H=A+Cmu+Csmu原因簽：化炒學(xué)鍵興合相降，液佛體流托動(dòng)相結(jié)果捆：HP出LC的實(shí)茅驗(yàn)條條件應(yīng)拿該是鳥：①小粒圈度、育均勻斤的球世形化彩學(xué)鍵吐合相也；②低粘鹿度流披動(dòng)相塵，流漲速不墊宜過擺快；③柱溫堂適當(dāng)宜。HP格LC中的貪速率怎理論33（二挑）正派相鍵某合相鎖色譜天法的競(jìng)分離手條件固定泉相極性問鍵合農(nóng)相孩如氰卵基、講氨基揭鍵合絨相等流動(dòng)紡相烷烴派加適纏量極金性調(diào)社節(jié)劑34（三廢）反夾相鍵顯合相馳色譜邁法的層分離家條件固定語(yǔ)相非極概性鍵微合相劃如OD躲S流動(dòng)烈相以水昂為基像礎(chǔ)溶耐劑，畢加入供甲醇陡、乙僅腈等葡極性坦調(diào)節(jié)娘劑弱酸釋、弱躍堿或撓緩沖紫鹽作濁為離版子抑劉制劑加入0.楊1%走∽1乎%的醋界酸鹽臟、磷滲酸鹽粗可減賴少殘快余硅控醇基時(shí)的作后用35（四曉）反步相離慘子對(duì)溝色譜利法的腥分離喪條件固定輪相辨盡可譜能選批擇表殃面覆汪蓋度蠢高且帆疏水械性強(qiáng)來的非著極性條鍵合輸相，離子撐對(duì)試光劑糠離子雜對(duì)試脊劑所醒帶的糕電荷芳應(yīng)與遍試樣設(shè)離子調(diào)的電哀荷相惑反流動(dòng)辦相pH使試莊樣組乎分與睜離子秩對(duì)試儉劑全荷部離裁子化有機(jī)繞溶劑養(yǎng)及其交濃度削同一聾般HP疾LC36第三春節(jié)友高效罪液相左色譜宇儀組成輸液溫系統(tǒng)進(jìn)樣督系統(tǒng)色譜例柱系丑統(tǒng)檢測(cè)南系統(tǒng)數(shù)據(jù)駛記錄港處理但系統(tǒng)37一、系輸液皇系統(tǒng)高壓爸輸液滋泵恒流用泵：宵在輸蔬送流擋動(dòng)相伸過程咸中流登量恒邪定。索常用的柱塞咱往復(fù)患泵雙泵汁：為關(guān)了克貪服流鋒量的殖脈動(dòng)監(jiān)。桐有漲串聯(lián)禾式和上并聯(lián)昌式3839輸液情系統(tǒng)輸液妹泵應(yīng)牛具備航的性瘡能：流量繁精度棵高且外穩(wěn)定流量扒范圍稈寬能在秋高壓滲下連才續(xù)工油作液缸溝容積姨小密封長(zhǎng)性能飄好，視耐腐廚蝕40輸液系系統(tǒng)輸液秘泵操稀作注咳意事顆項(xiàng)：防止持固體絲式微粒壟進(jìn)入確泵體流動(dòng)匆相不沸應(yīng)含息有腐處蝕性侄物質(zhì)防止喇溶劑厭瓶?jī)?nèi)隨的流攔動(dòng)相佩被用為完不超丈過規(guī)危定的橫最高鑒壓力流動(dòng)趕相一孕般應(yīng)駱該先旁脫氣41二、售分離看和進(jìn)釘樣系關(guān)統(tǒng)進(jìn)樣器進(jìn)樣西閥（尖六通輪閥）夾、自甩動(dòng)進(jìn)詠樣裝偉置色譜蹈柱（co常lu籃mn）由柱饒管和洗固定奸相組壟成分析酸柱、產(chǎn)制備術(shù)柱性能跨評(píng)價(jià)H、n、fs、k和α的重畏復(fù)性草，或R。4243三、觸檢測(cè)研系統(tǒng)（一咽）檢耽測(cè)器(d捉et沫ec鈴to紙r)的主犯要性頁(yè)能要求鈔：靈敏昆度（se歐ns孟it貪iv掙it惠y）高（夕檢測(cè)額限低棍）噪音咐（no壓is蒙e）低線性出范圍役（li汪ne置ar記r唱an花ge）寬重復(fù)缺性（re緩pe碧at抵ab穴il惱it勵(lì)y）好適用欲范圍勸廣（起通用熔型、衫專屬摧型）44（二槐）紫迎外檢塊測(cè)器(u澆lt腐ra閑vi嚇ol處et伶d芹et諒ec緞to捏r)檢測(cè)兩原理子：朗伯天－比榜爾(L載am縣be秩rt張-B肥ee僚r)定律定，響牧應(yīng)信疫號(hào)（潑吸光瞧度）飾與濃手度成粉正比A=εC鑒l特點(diǎn)書：靈敏員度較剪高（10-6—1撈0-9g/侍ml），噪音惹低，鐵線性趨范圍聾寬，腰穩(wěn)定質(zhì)性好萍，適培于梯粱度，位不破比壞樣傻品，分應(yīng)用傍廣（耗分析阻、制瘦備）轉(zhuǎn)。局限壺：只能惹檢測(cè)嬌有紫其外吸退收的倦物質(zhì)溜，流無動(dòng)相嶄的截截止波密長(zhǎng)應(yīng)待小于蕩檢測(cè)讀波長(zhǎng)嬌。專屬型、文濃度加型檢翅測(cè)器45紫外線檢測(cè)情器固定窄波長(zhǎng)崗檢測(cè)粒器視：25獨(dú)4n紙m可變廢波長(zhǎng)蹲檢測(cè)練器：光源杏：氘繞燈（暗和鎢夏燈），20觸0—生40科0（80鴨0）nm，單色消器，量流通渾池（臨試樣脹），配光電管光路停系統(tǒng)德和紫勒外分珠光光篇度計(jì)蕉相似光電壯二極跟管陣譜列檢拔測(cè)器(p艦ho銷to勿di都o(jì)d割e反ar皆ra奮y疤de舉te案ct機(jī)or；PD南AD利)：一系邪列光群電二循極管恩，一個(gè)學(xué)二極膠管對(duì)建應(yīng)接犧受光停譜上移約1n錄m譜帶王寬的僅單色表光4647紫外鬧檢測(cè)匪器光電竊二極腐管陣蚊列檢且測(cè)器工作微原理?。簭?fù)揮光通臭過流掏通池劫，再德進(jìn)入箱單色鄭器，柿分光桑后照膝射在制二極侄管陣頓列裝瘡置上蘋，同幸時(shí)獲島得各帆波長(zhǎng)易的信淡號(hào)強(qiáng)鎮(zhèn)度，謀即獲來得組鍵分的綢吸收僻光譜秩。獲田得三錫維光蠢譜－狼色譜蹦圖。用途