心力衰竭藥理學(xué)研究進(jìn)度

心力衰竭藥理學(xué)研究進(jìn)度

表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因及基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的變化。這些改變包括DNA的甲基化、多種形式的組蛋白修飾及小分子RNA等。個(gè)體間疾病易感性及治療反應(yīng)性的差異在很大程度上取決于遺傳因素[1]。然而，根據(jù)全基因組研究，筆者不得不承認(rèn)遺傳表型的改變不僅僅是核苷酸序列的變化[2-3]。表觀遺傳學(xué)與核苷酸的改變共同調(diào)控了基因的表達(dá)，因而從另一種角度解釋了個(gè)體間的差異。

表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，基因及其表達(dá)的遺傳性改變不僅僅是指基因突變或基因多樣性等DNA序列的變化。已知的三種可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)改變主要是：基因組DNA的甲基化，組蛋白修飾，非編碼RNA的調(diào)節(jié)。上述機(jī)制均涉及外在因素在蛋白質(zhì)編碼序列不變的情況下仍可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[4]。表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制存在個(gè)體及組織差異性，并且可以隨年齡增長(zhǎng)、環(huán)境及疾病狀態(tài)的改變而變化。表觀基因組在基因組表達(dá)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，個(gè)體間基因表達(dá)的不同造成藥物不同的反應(yīng)性，這可能是通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變進(jìn)行調(diào)節(jié)的。因此，目前認(rèn)為表觀遺傳學(xué)改變可以幫助解釋基因突變?cè)谒幬锓磻?yīng)中的作用，繼而在臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮作用，這一迅速崛起的新學(xué)科稱為表觀遺傳藥理學(xué)。個(gè)體間藥物的反應(yīng)性不同，該學(xué)科不僅研究表觀遺傳因子在這一過(guò)程中的作用，而且旨在開(kāi)發(fā)新的藥物靶點(diǎn)[5]。筆者認(rèn)為表觀遺傳藥理學(xué)與遺傳藥理學(xué)將共同在藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要作用。目前為止，表觀遺傳藥理學(xué)的大多數(shù)研究集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域，例如，研究細(xì)胞色素p450在個(gè)體間表達(dá)的差異。幸運(yùn)的是，表觀遺傳學(xué)修飾的作用已被應(yīng)用于解釋其他復(fù)雜并且多源的現(xiàn)象，應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣。在這里，筆者總結(jié)了表觀遺傳修飾在心衰及心血管疾病治療方面最新的研究。

1表觀遺傳修飾與心力衰竭

組蛋白的修飾

龐大的真核生物基因組在高度保守的組蛋白的作用下得到了緊密的壓縮。在核小體中，基因組DNA圍繞核心組蛋白折疊、壓縮，形成了染色體的基本單位?；蚪MDNA與染色體蛋白的相互作用有助于轉(zhuǎn)錄因子向靶基因片段聚集，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性[6]。通過(guò)這種機(jī)制，核小體利用其核心組蛋白的共價(jià)修飾傳遞表觀遺傳學(xué)信息。這些修飾包括組蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化修飾。核心組蛋白的氨基末端從染色質(zhì)絲上伸出來(lái)，與DNA或其他組蛋白、蛋白質(zhì)等相互作用。該末端上的賴氨酸、精氨酸殘基是組蛋白修飾的主要靶點(diǎn)。多數(shù)研究旨在了解賴氨酸乙?；?、甲基化的作用。事實(shí)證明，賴氨酸的乙酰化作用主要與染色質(zhì)親和力及轉(zhuǎn)錄相關(guān)，而賴氨酸的甲基化作用取決于何種殘基被修飾。有趣的是，正如Mano所總結(jié)的那樣，組蛋白乙?；恼{(diào)控與心肌肥厚相關(guān)。去氧腎上腺素可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，這一過(guò)程需要乙酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的組蛋白乙?；?。與此結(jié)果相一致的研究是針對(duì)Ⅱ類組蛋白去乙?；?、9的研究，其通過(guò)抑制心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2的活性進(jìn)一步阻礙致肥厚基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗肥厚的作用。與此相反，Ⅰ類HDACs具有相當(dāng)強(qiáng)的致肥厚作用，其通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇三磷酸酰胺磷酸酯酶的表達(dá)發(fā)揮作用。這意味著，HDACs在多水平上控制肌肉細(xì)胞的體積。

甲基化

在真核生物中，DNA甲基化是通過(guò)將甲基團(tuán)轉(zhuǎn)移到核苷酸胞嘧啶環(huán)的5''''位碳原子上完成的。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，DNA甲基化主要發(fā)生在基因的5''''-CG-3''''序列，也指的是CpG雙核苷酸；人體內(nèi)，大約70%的CpGs發(fā)生甲基化。另一方面，未甲基化的CpGs存在于許多基因的5''''端調(diào)控區(qū)域，以CpG島的形式出現(xiàn)。與其他DNA區(qū)域相比，CpG雙核苷酸在CpG島出現(xiàn)的概率較高。人體內(nèi)CpG島甲基化的不同是表觀遺傳學(xué)改變的組成部分。DNA胞嘧啶甲基化有助于局部轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的結(jié)合，其與組蛋白修飾共同在局部及整個(gè)基因組中影響染色體的結(jié)構(gòu)。因此，DNA甲基化的一個(gè)重要作用是調(diào)控基因的表達(dá)。在這方面，CpG島超甲基化可以使基因沉默，而低甲基化使基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。有人認(rèn)為，甲基化是一種穩(wěn)定遺傳的修飾，但同時(shí)它也受到環(huán)境因素的影響。如小鼠野鼠色基因位點(diǎn)，可以受到其上游轉(zhuǎn)座子甲基化狀態(tài)的影響。從遺傳角度來(lái)講，完全相同的親代其野鼠色基因不同的甲基化狀態(tài)可使得后代出現(xiàn)不同的毛色[7]。最近，Kao等[8]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在心衰特定的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。他們發(fā)現(xiàn)促炎癥基因TNF-α可下調(diào)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的表達(dá)，這是通過(guò)增強(qiáng)SERCA2A啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)完成的。Movassagh等[9]發(fā)現(xiàn)，在心肌病及人類心肌組織形成時(shí)甲基化的狀態(tài)是不同的。而且，他們鑒別出三個(gè)基因位點(diǎn)，在不同的心臟樣本中，位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)。

MicroRNAs是短的雙鏈RNA分子，來(lái)源于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中較大的RNA前體，其可以在基因轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。miRNAs可以對(duì)30%～50%的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行調(diào)控，這一過(guò)程主要是通過(guò)與mRNA3''''端未轉(zhuǎn)錄區(qū)域的堿基對(duì)進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，繼而干擾轉(zhuǎn)錄，靶mRNAs可降解或暫時(shí)沉默[10]。miRNAs調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)是非常復(fù)雜的，多種miR-NAs可以作用于同一基因，不同基因也可受到同一種miR-NAs的調(diào)節(jié)。miRNAs的表達(dá)具有組織、疾病特異性。近年來(lái)，多種病理狀態(tài)下的miRNA分子標(biāo)記已被檢測(cè)出來(lái)，如各種類型的腫瘤以及多種心血管疾病[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs與基本的細(xì)胞功能密切相關(guān)。目前，miRNAs與心衰的關(guān)系已得到明確，在過(guò)去的幾年中，該領(lǐng)域的報(bào)道層出不窮。對(duì)心血管疾病的研究主要集中于兩種心臟組織特異表達(dá)的miRNA家族。多項(xiàng)研究顯示，miRNA在健康、高血壓以及不同病因所導(dǎo)致的人、小鼠、大鼠衰竭的心臟中均有表達(dá)，Divakaran等[12]發(fā)現(xiàn)心臟特異性的miRNA-208不僅可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大、纖維化同時(shí)可在應(yīng)激、甲退時(shí)調(diào)節(jié)β-肌球蛋白重鏈的表達(dá)。這種miRNA由α-MHC基因的內(nèi)含子編碼。該基因編碼α-MHC及一種主要的心肌收縮蛋白，使心臟變大，在應(yīng)激以及激素信號(hào)作用下通過(guò)miR-NA-208及其作用位點(diǎn)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。再者，定向刪除心肌特異性的miRNA，miRNA-1-2，揭示了它們?cè)谛呐K中的多種功能，包括調(diào)節(jié)心臟的形態(tài)發(fā)生、電信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞周期的調(diào)控。Thum等[13]發(fā)現(xiàn)，受損心肌中miRNA標(biāo)記與胚胎心中miRNA表達(dá)的類型極為相似，這說(shuō)明受損心肌中重啟了胚胎基因的表達(dá)程序。Thum等[13]另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是miRNA-21可以調(diào)控ERK-MAP激酶途徑，這種調(diào)控在心臟成纖維細(xì)胞中尤為明顯，心肌細(xì)胞中卻沒(méi)有這種表現(xiàn)，這可以影響到心臟的結(jié)構(gòu)及功能。在成纖維細(xì)胞中，miRNA-21水平的增高可通過(guò)抑制特定基因來(lái)激活ERK激酶，經(jīng)由這種機(jī)制，miRNA-21調(diào)節(jié)了間質(zhì)纖維化、心肌肥厚。上述研究揭示了在心臟成纖維細(xì)胞中，基因調(diào)節(jié)的另一種方式是在miRNA介導(dǎo)的旁分泌水平上進(jìn)行的。miRNA在心臟肥厚反應(yīng)中的意義得到了進(jìn)一步的研究，miRNA成為基因調(diào)控的主要調(diào)節(jié)因子。到目前為止，miRNA已被證實(shí)不僅可以影響心肌，還可以影響心臟電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)血管再生[14]。

2表觀遺傳篩選方法

表觀基因組學(xué)示意圖不是固定的，它因細(xì)胞類型、時(shí)間的不同而不同，并且可在生理學(xué)、病理學(xué)、藥物作用情況下發(fā)生改變。因此，作為人類基因組計(jì)劃的后續(xù)工程，表觀基因組測(cè)序是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。雖然判斷基因組序列的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)是比較容易完成的，描繪整個(gè)表觀基因組需要對(duì)數(shù)十個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，覆蓋一個(gè)有機(jī)體在生命不同階段的所有細(xì)胞類型。亞硫酸氫鹽測(cè)序法是標(biāo)測(cè)DNA甲基化類型最為準(zhǔn)確的方法?；蚪MDNA與亞硫酸氫鈉相作用，導(dǎo)致未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。為觀察特定基因的甲基化狀態(tài)，用特異性引物對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后對(duì)產(chǎn)物測(cè)序。在序列中，甲基化的胞嘧啶被標(biāo)記為Cs，未甲基化的胞嘧啶為T(mén)s。近來(lái)出現(xiàn)了多個(gè)對(duì)甲基化進(jìn)行定位的全基因組研究方法，它們都是以甲基化和未甲基化的CpGs對(duì)限制性內(nèi)切酶的敏感性不同為基本原理的。限制長(zhǎng)度的基因組掃描利用兩種酶雙酶切DNA，一種是頻繁切割的甲基化非敏感性限制內(nèi)切酶，另一種是罕見(jiàn)的甲基化敏感性的酶如Not1，這種酶只有在非甲基化狀態(tài)時(shí)才可以酶切所識(shí)別的位點(diǎn)。還有一種完全不同全基因組研究方法是利用DNA芯片技術(shù)，它可以一次性標(biāo)測(cè)成千上萬(wàn)的CpG島的甲基化狀態(tài)。這種方法可以用來(lái)識(shí)別CpG島，相對(duì)于正常的調(diào)控過(guò)程來(lái)說(shuō)，CpG島在腫瘤組織中發(fā)生甲基化。亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的替代方法是ChIP-seq方法。通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)使得目的蛋白與DNA發(fā)生交聯(lián)，然后對(duì)DNA片段進(jìn)行基因組測(cè)序。這一方法可以幫助識(shí)別任何DNA相關(guān)蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)還可以提供組蛋白修飾的信息，如乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化修飾。對(duì)ChIP技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)得到的DCS方法，是將ChIP與消減式PCR進(jìn)行偶聯(lián)。該方法旨在避免基因組片段與芯片雜交后產(chǎn)生非特異性信號(hào)。以同樣的方式可以檢測(cè)人體病理狀態(tài)下miRNA的作用，大多數(shù)研究是利用高通量的方法分析臨床病例中總miRNA的表達(dá)情況。高通量技術(shù)是以miRNA基因芯片和real-timeRCP為代表的。盡管分子間的差別給這些技術(shù)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，但miRNA芯片最大的優(yōu)點(diǎn)是具有很高的特異性，而缺陷是其敏感性較低。

3藥物可以改變表觀遺傳狀態(tài)

表觀遺傳學(xué)改變正常及疾病狀態(tài)下的表型，這可能意味著充分理解和調(diào)控表觀基因組對(duì)于人類常見(jiàn)疾病的防治具有重要意義。表觀遺傳學(xué)為我們提供了一個(gè)重要的窗口，來(lái)認(rèn)識(shí)環(huán)境與基因在疾病發(fā)生過(guò)程中的相互作用以如何調(diào)節(jié)這些作用達(dá)到改善人類健康的目的。miRNA派生的反義寡核苷酸是單鏈RNA分子，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾可能是針對(duì)致病miRNA新的方法。但是這種方法困難重重，miRNA屬于密切相關(guān)的家族，且很難合成針對(duì)每一種miRNA的反義寡核苷酸。再者，一個(gè)單獨(dú)的miRNA可針對(duì)多種基因發(fā)揮作用，它們之中可能含有對(duì)心肌有益的分子。在這方面，寡核苷酸的化學(xué)修飾可能會(huì)特異性破壞miRNA與單個(gè)mRNA的作用，這可能是疾病治療良好的備選方案。每一種miRNA可以以不同的強(qiáng)度針對(duì)成百上千的基因發(fā)揮作用，所以在體內(nèi)miRNA修飾的最終作用尚不明了。最終，將miRNA拮抗劑應(yīng)用于臨床領(lǐng)域?qū)⒚媾R很多困難，這與我們?cè)诨蛑委煼矫嫠龅降臉O為相似，如導(dǎo)入方式、載體、特異性以及毒性等問(wèn)題[15]。至少在理論上，針對(duì)特異性miRNA的方法將來(lái)可能是治療缺血性心臟病、心肌肥厚、心衰、血管再生、離子通道病的有效手段，可控制心衰的發(fā)展。另一種方法可能是將靶DNA甲基化。一些影響基因組DNA甲基化的化學(xué)合成劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床，例如5-氮胞嘧啶、抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的氮胞嘧啶可以使DNA片段脫氨基。其它藥物是通過(guò)阻礙甲基化酶的活性而發(fā)揮抑制甲基化作用。更多信息可參照Gomez等[16]的文章。除了要開(kāi)發(fā)可以調(diào)節(jié)DNA甲基化的藥物外，還需要設(shè)計(jì)可以影響組蛋白修飾的藥物。在抗腫瘤藥物的發(fā)展過(guò)程中，組蛋白去乙酰化酶抑制劑占據(jù)著重要地位，它可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)與腫瘤相關(guān)的異常表觀遺傳改變，繼而發(fā)揮作用。已有證據(jù)表明，在心肌肥厚時(shí)，HDAC抑制劑可修復(fù)基因表達(dá)程序。Gallo等證明體外試驗(yàn)中，曲古霉素A、丁酸鈉可延緩心臟肥厚。

4表觀遺傳學(xué)和環(huán)境

眾所周知，環(huán)境因素如毒素、飲食可以影響DNA甲基化和染色質(zhì)修飾，并且可遺傳給下一代。雌激素、抗雄激素類物質(zhì)可改變DNA甲基化狀態(tài)降低男性的生育能力，這也是可遺傳的。該假說(shuō)認(rèn)為，環(huán)境因素可以改變表觀遺傳學(xué)標(biāo)記和基因表達(dá)形式，這可能在人類疾病研究中具有重要意義。常見(jiàn)疾病大多受到基因和環(huán)境因素的雙重影響，環(huán)境可誘導(dǎo)表觀遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而將基因和環(huán)境因素聯(lián)系起來(lái)[17]。年齡在基因與環(huán)境相互作用中發(fā)揮重要作用。常見(jiàn)病的發(fā)病率隨著年齡的增加不斷增高，這與在人的一生中表觀遺傳學(xué)改變不斷累積有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于年輕者而言，年長(zhǎng)的同卵雙胞胎體內(nèi)總DNA甲基化及組蛋白H3K9乙?；乃捷^高，但該研究沒(méi)有檢測(cè)同一個(gè)體中表觀遺傳學(xué)改變隨時(shí)間變化的情況。

5結(jié)論

表觀遺傳學(xué)為研究個(gè)體在臨床療效、藥物反應(yīng)及毒性間的差異，以及發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)等方面開(kāi)