WB實(shí)戰(zhàn)指南+正確使用QuantityOne定量

WB實(shí)戰(zhàn)指南+正確使用品制備：變性條件——SDSLB直接裂解：用常溫或者高溫預(yù)熱過(guò)〔預(yù)熱更有利于阻擋蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但簡(jiǎn)潔遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)變的1*SDSLB〔1.5*〕直接加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。680%200ul，其他按平板面積比類(lèi)推。通常條件下，SDSLB都是過(guò)量的〔因此不愿定要嚴(yán)格參考SDSLB稀釋比〕；假設(shè)SDSLB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過(guò)高時(shí)，煮樣后會(huì)覺(jué)察tip吸不上來(lái)，格外粘、一砣一砣的，很簡(jiǎn)潔堵住tip。這時(shí)候常規(guī)做法有兩種，1.再煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5min，樣品過(guò)濃時(shí)就煮10min；2.假設(shè)10min煮樣后，照舊吸不起來(lái)，才適當(dāng)增加SDSLB，連續(xù)煮；也可以對(duì)樣品進(jìn)展超聲。煮樣時(shí)間假設(shè)過(guò)長(zhǎng)，蛋白會(huì)凝固，此時(shí)以失去連續(xù)WB的意義，請(qǐng)丟棄〔推斷標(biāo)準(zhǔn)：消滅明顯的蛋白沉淀和水分層〕此方法的缺點(diǎn)，SDSLB煮過(guò)的樣品假設(shè)用來(lái)做IP，需要特別方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法〔不爭(zhēng)論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分別等等了，其實(shí)類(lèi)似〕裂解細(xì)胞請(qǐng)盡量冰上操作，減緩酶解作用。俺前bossnature文章上的裂解液配方是20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors(20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin)〔此裂解液可用于抽提核蛋白〕，其中蛋白酶抑制劑很簡(jiǎn)潔也很貴0.5mMPMSF替代這三種就好了；假設(shè)還要做磷酸化蛋白，加1mMNa3VO4〔現(xiàn)加現(xiàn)用〕，10mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫存，便于隨后的IPNa0.15M〔生理鹽濃度〕、0.3M、0.6M〔高鹽系列，裂解細(xì)胞時(shí)染色體會(huì)析出，細(xì)胞碎片和沉淀格外粘稠〕及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗(yàn)，0.6M一些復(fù)合體的組成蛋白一般承受極端的高鹽裂解細(xì)胞。用于核蛋白的裂解的緣由是0.5%NP-40，用于破壞核膜構(gòu)造；可用到1%，但此時(shí)染色體會(huì)析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿的方法最適宜，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。50mg穎癌組織，我承受的方法是低溫〔剪〕攪碎，成肉糜狀。錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊〔把握力氣，盡量避開(kāi)弄破錫箔紙〕，進(jìn)一步裂開(kāi)；反復(fù)屢次。用上述細(xì)胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無(wú)血清培育基培育細(xì)胞，收集上清液用于WB檢測(cè)；假設(shè)含量過(guò)低，需要用TCA沉淀富集。件；但是這存在隱憂。由于含血清的培育基中含有格外豐富的BSA〔牛血清白蛋白〕之類(lèi)的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分別純化，否則直接用這種樣品去WB會(huì)有格外大的麻煩，尤其當(dāng)你的蛋白在60-46kDa之間的時(shí)候；用“任何”抗體去檢測(cè)這一區(qū)間的蛋白，會(huì)有一片格外強(qiáng)的信號(hào)。由于此區(qū)間蛋白〔主要是BSA〕“任意”抗體，從而最終被識(shí)別。同理，承受SDSLB裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培育基中的BSA?！睞KT等〕，還會(huì)消滅的問(wèn)題是：即使承受了無(wú)血清收集上清，照舊有大量雜蛋白，但相對(duì)好很多。選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要承受TCA沉淀富集，再重溶解。TCA沉淀對(duì)半定量操作要求格外高，由于很簡(jiǎn)潔沉淀不充分或者離心操作喪失，尤其在離心過(guò)程，離心管的擺放格外講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。b。重溶解時(shí)，由于蛋白需要在確定的鹽離子條件下才能重溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對(duì)麻煩。量的WB試驗(yàn)檢測(cè)不同樣品間的差異。這里面有試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)的麻煩——閱歷之談，我曾經(jīng)參與的cancercell文章所爭(zhēng)論的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的數(shù)據(jù)是celllysis；間或用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進(jìn)一步分析做預(yù)備。樣品制備完，應(yīng)馬上低溫保存〔-20度短期〔幾天〕；-80度長(zhǎng)期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)展IP，避開(kāi)凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用。SDSLB煮沸過(guò)的樣品凍融會(huì)存在另一個(gè)問(wèn)題，SDS沉淀；SDS4度就會(huì)沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶〔SDSLB不夠，樣品未充分溶解也會(huì)消滅類(lèi)似拖尾；上樣過(guò)大也會(huì)〕。在樣品制備過(guò)程中，另一個(gè)需要留意的問(wèn)題是，從樣品制備的起始階段就要留意定量問(wèn)題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太微小的差特別常無(wú)視不計(jì)。細(xì)胞樣品可以先計(jì)數(shù)再接種，短時(shí)間內(nèi)即使細(xì)胞生長(zhǎng)有差異也不會(huì)對(duì)WB〔稱(chēng)重〕蛋白定量，我將下一節(jié)爭(zhēng)論蛋白定量的不科學(xué)性，以及裂解液成分對(duì)定量的干擾?！狙a(bǔ)充1】：細(xì)胞有凋亡或生長(zhǎng)速率差異時(shí)，有一個(gè)最直接的方法針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，實(shí)際上將細(xì)胞收集下來(lái)以后，經(jīng)過(guò)離心，去除PBS，這時(shí)候你可以拿出事先預(yù)備好的標(biāo)準(zhǔn)體積去比對(duì)，誤差小于50ul的〔由于標(biāo)準(zhǔn)品差值可以設(shè)定為50ul),10ul〔細(xì)胞體積WB結(jié)果中可以無(wú)視不計(jì)。effendorf管。最好不要用純水做標(biāo)準(zhǔn)品，我寵愛(ài)稀釋一些SDSLB做標(biāo)準(zhǔn)品，由于有藍(lán)黑色比照下，可以更準(zhǔn)確估量體積。這相比照測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再一一讀值還是快很多；蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請(qǐng)參考分子克隆。閱歷之談，8%膠最底邊約36KDa，10%25KDa，12%12KDa。8%300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的的影響都問(wèn)題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的影響都問(wèn)題不大〔300KDa蛋白如何，沒(méi)有嘗試過(guò)〕。電泳一般承受恒流，45mA-55mA〔應(yīng)依據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要留意儀器最高限壓；此條件適合gibcomodelV16型，膠寬20cm〕。承受恒流的優(yōu)點(diǎn)，保證最快速度完成電泳〔電壓會(huì)漸漸增大〕方法散熱。散熱不好，條帶消滅波浪狀。留意事項(xiàng)：30%4度避光保存。APS會(huì)失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個(gè)月左右。-20度分裝長(zhǎng)期保存。留意TrisbuffPH值，以及尋常所用的水的PH值。PH值轉(zhuǎn)變會(huì)使帶型格外怪異，〔即便在分別膠中〕，料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)始終延長(zhǎng)到膠底部〔溴酚藍(lán)此時(shí)涌動(dòng)極緩慢，位于膠中上部〕4．上下層式電泳裝置假設(shè)漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會(huì)過(guò)熱。SDS-膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。5．配膠用玻璃板和邊條應(yīng)準(zhǔn)時(shí)洗凈。玻板未洗凈的害處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些微小〔摸上去疙疙瘩瘩〕，其害處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過(guò)該處或電泳散熱不好，條帶變形。假設(shè)是RNA〔夾在玻板〔比水更好，有SDS潤(rùn)滑〕。推斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒(méi)有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類(lèi)不好用。上樣時(shí)，不要把tip深入膠孔過(guò)深〔或者承受細(xì)的尖端拉長(zhǎng)的專(zhuān)用上樣槍頭〕，可能會(huì)錯(cuò)開(kāi)膠和玻板，樣品會(huì)泄露。SDSLB20ul〔含5ul4*SDSLB〕，8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，點(diǎn)marker的lane也要參與同樣體積的LB。LB假設(shè)在室溫放置太久和穎的在比重上會(huì)有差異，在舊LB靠近的地方，條帶會(huì)拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)全都。LB應(yīng)-20度保存。8．的蛋白條帶都扭曲變形。由于增加上樣量最多只能提高幾倍，而WB10的幾次冪量級(jí)的，全部目的蛋白信號(hào)的唯一方案就是IP富集〔可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾〕。增加上樣量的另一個(gè)害處是，原來(lái)高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能消滅熒光灼燒式粹滅〔一晃而滅〕或者條帶中空。仍以6孔板80以上集合度為例細(xì)胞裂解液和SDSLB通常都是投入200l 最少80u，這種濃度條件下制備的樣品，電泳時(shí)上樣量要把握在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ulWB結(jié)果影響不大〔沒(méi)有的照舊沒(méi)有〕，且條帶都很丑。IP樣品和一組細(xì)胞裂解15ul，剛好+5ul4*SDSLB20ul上樣體積；后者第85ul，同樣+5ulSDSLB〔比重同，不會(huì)相互擠壓〕，最好補(bǔ)加10ulDDW使“空白”〔空白僅指無(wú)蛋白，8-8.5ul4*SDSLB〕，這樣才能確保每條帶都很美觀。SDS〔拔去梳子和底邊邊條后的間隙〕，用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長(zhǎng)期4度保存。個(gè)人習(xí)慣為，灌好分別膠次日工作量較大，可以提前灌好SDS。樣品是否確定需要定量再上樣？——不是的，這是鋪張時(shí)間的一個(gè)操作。我們首先來(lái)爭(zhēng)論一下蛋白定量的科學(xué)性。蛋白定量首先需要一個(gè)參照系〔標(biāo)準(zhǔn)蛋白〕，參照蛋白通常選擇BSA，也就是說(shuō)你所謂的定量是對(duì)應(yīng)于BSA的濃度的一個(gè)參照值。這里面存在一個(gè)問(wèn)題，即無(wú)視了蛋白折疊和空間默認(rèn)將全部的蛋白等同于BSA在溶液中的折疊狀態(tài)、光吸取狀況下，然后做出的一個(gè)相對(duì)推斷，這就存在一個(gè)“系統(tǒng)誤差”——還不算上測(cè)量誤差等等，就已經(jīng)很不準(zhǔn)確了。其次，裂解組織或細(xì)胞的時(shí)候，那些裂解液中，某些溶劑本身會(huì)使CoomassieG250或者Bradford法〔實(shí)際也是Coomassie染色〕顯色，尤其是去污劑之類(lèi)；例如NP40，就會(huì)使Coomassie顯藍(lán)色，可以完全掩蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生的藍(lán)色。因此，假設(shè)你的NP40NP40會(huì)這樣，由于我們從來(lái)不去定量，沒(méi)有做過(guò)更深入的爭(zhēng)論。】跑少量的樣品，目的是讓Actintubulin更清楚、不會(huì)粘連、不會(huì)過(guò)曝光。從而在其次輪0.1ul〔我很多體外生化試驗(yàn)之前的調(diào)整酶量就是這樣進(jìn)展，此時(shí)根本不行能有足夠的蛋白讓你去定量〕。固然憑曝光強(qiáng)弱調(diào)整上樣量的前提是，你的WB技術(shù)很穩(wěn)定，很牢靠，這是需要相當(dāng)多的閱歷積存，假設(shè)你一時(shí)把握不了，可以讓閱歷更豐富的師兄師姐或者導(dǎo)師幫助。順便提到，有人問(wèn)過(guò)用QuantityOne等定量軟件對(duì)光密度定量后計(jì)算差異從而調(diào)整上樣體積是否可以？——不行以。由于WB結(jié)果經(jīng)過(guò)多重放大，準(zhǔn)確計(jì)量只代表相對(duì)于比照組的相比照值，與實(shí)際比值還是有誤差，所以按計(jì)算值更改上樣量仍會(huì)消滅偏差。假設(shè)非要做定量的話，要留意你的裂解液配方，把每種溶劑都先參與到顯色液中嘗試一下，白的提取。所以這是一個(gè)兩難的問(wèn)題。轉(zhuǎn)印——轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果的影響并不如書(shū)本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚(yáng)的那么大！首先必需澄清的是，很多時(shí)候手會(huì)把WB結(jié)果無(wú)信號(hào)歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實(shí)際上轉(zhuǎn)膜如何正確使用抗體，這個(gè)問(wèn)題下節(jié)爭(zhēng)論。有一個(gè)簡(jiǎn)潔的例證，Biorad3mm厚濾紙初次使用時(shí)，通常轉(zhuǎn)膜效果不抱負(fù)〔從預(yù)染的marker深淺可知〕，但對(duì)多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測(cè)沒(méi)有任何影響〔建議少用這種濾紙做那種含量特別稀有或者轉(zhuǎn)膜格外困難的蛋白問(wèn)題；嘗試過(guò)浸泡〔會(huì)泡爛的〕、預(yù)電泳〔會(huì)略微好點(diǎn)〕等等，效果均不抱負(fù)。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。每次用完后清水略微沖洗一下外表鹽分〔要把握水流；水流太大，紙張會(huì)爛掉的〕，晾干再用；只要沒(méi)沖爛可以始終反復(fù)使用。其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起打算性作用，但由于WB的流程相對(duì)較長(zhǎng)，所以每個(gè)步驟的疊加作高轉(zhuǎn)膜效率。針對(duì)提高轉(zhuǎn)膜的效率，個(gè)人認(rèn)為最先應(yīng)當(dāng)考慮到的是儀器的選用。這里不是卑視“madeinChina”，國(guó)內(nèi)的廠家很少留意不斷提高自己產(chǎn)品的品質(zhì)，走低端策略〔屬板外表是鍍過(guò)極薄的白金層〕使用過(guò)的國(guó)產(chǎn)電轉(zhuǎn)槽〔濕轉(zhuǎn)〕唯Tanon仿Biorad的還可以〔算替它們免費(fèi)打個(gè)廣告吧，Tanonbioradmini3型電泳儀，在某些方面〔主要是操作〕上還優(yōu)于Biorad原裝；目前我認(rèn)為“中國(guó)制造”的靈魂就是仿造并超越前者Bioradamersham和英國(guó)公司的scie－plas。PS：批判一下BioradBiorad〔絕非摔裂、自然就會(huì)碎裂〕〔其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則無(wú)法接通，導(dǎo)致儀器報(bào)廢——3臺(tái)都是這3年，不能確定近來(lái)Biorad有沒(méi)有改進(jìn)這個(gè)問(wèn)題；假設(shè)沒(méi)有，我想市場(chǎng)遲早會(huì)被其他公司所取代〕對(duì)這三款產(chǎn)品，Biorad的外殼有明顯的質(zhì)量缺陷，簡(jiǎn)潔過(guò)早報(bào)廢；amersham獨(dú)特的蜂窩式設(shè)計(jì)確實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸面削減，電轉(zhuǎn)時(shí)散熱不太好，做大蛋白〔半干轉(zhuǎn)儀也可以做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確實(shí)不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度一般時(shí)仍可承受〕長(zhǎng)時(shí)程〔3hrs〕轉(zhuǎn)膜需要在4度冰柜或coldroom進(jìn)展；英國(guó)的產(chǎn)品，價(jià)格較高，公司不太知名國(guó)內(nèi)不愿定有代理，但質(zhì)量和散熱都格外好。這里談到了半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)〔下文會(huì)具體給出條件〕；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時(shí)、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋白，固然這只是一個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對(duì)大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會(huì)選擇長(zhǎng)時(shí)程的濕轉(zhuǎn)，那么剛剛提到的amersham半干轉(zhuǎn)儀的缺陷實(shí)際上上跳舞，此時(shí)轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒(méi)有任何意義——我說(shuō)過(guò)轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果不起打算因素。轉(zhuǎn)效果也格外抱負(fù)，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用屢次〔30V，～35V四周的時(shí)候，保險(xiǎn)會(huì)自動(dòng)跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3hr以后，最大電壓仍為18V〔因此足見(jiàn)其散熱性能的優(yōu)良〕。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時(shí)間的要求是針對(duì)PVDF膜的，這里面有一個(gè)很好玩的問(wèn)題。盡管廠家一再說(shuō)明PVDF膜比NC膜對(duì)蛋白的截留更高〔但NCTBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高〕，但PVDF膜對(duì)小分子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預(yù)染marker上的顏料小分子很簡(jiǎn)潔穿過(guò)PVDF〔除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮增加marker的上樣量〕；NC膜沒(méi)有這種問(wèn)題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時(shí)間也是小蛋白1hr3hrs200-300mA〔16cm*9cm大膠300mA，假設(shè)膠面積小很多可以考慮降低，實(shí)際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右〕。NC膜唯一不如PVDF膜的NC成分涂在另一種介質(zhì)的外表，這種膜的支持強(qiáng)度和PVDF膜類(lèi)似，但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時(shí)候要特別留意正反面。此外，20KDa以下0.22uM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也不是確定必需。對(duì)于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書(shū)本建議承受低濃度膠，如6%SDS-。但實(shí)際操作覺(jué)察，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作格外麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin45KDa四周，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示60KDa左右，除非承受壇子上有人提過(guò)的灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時(shí)跑兩塊膠300KDa8%〔36KDa〕7-8%膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白?！哺邷貢?huì)局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率低溫〔4度〕-20度預(yù)冷，時(shí)間不能長(zhǎng)于2hrs，否則電泳液凍結(jié)；mini3型有內(nèi)置冰槽的，冰槽置-80度預(yù)冷。制作轉(zhuǎn)膜三明治的過(guò)程中，書(shū)中強(qiáng)調(diào)過(guò)濾紙、膠、膜的大小最好全都，否則沒(méi)有膠、膜隔開(kāi)局部的濾紙會(huì)由于直接接觸而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電〔壓〕流，造成升溫過(guò)快。但切割好的和膠面積最接近的濾紙；通常膜的大小會(huì)嚴(yán)格把握在與膠面積全都或略小一點(diǎn)點(diǎn)。過(guò)大，膠會(huì)被拉伸，條帶會(huì)扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)除氣泡〔完全可以做到疊加萬(wàn)倍計(jì)的，因此更嚴(yán)密的接觸無(wú)疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵?！部梢韵鳒p與濾紙或者膜之間的氣泡〕；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾些緩沖液會(huì)有利于削減氣泡〔PVDF要先用甲醇潮濕再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液〕。如何監(jiān)控轉(zhuǎn)膜的效率呢？的操作時(shí)間，而且不能說(shuō)明任何問(wèn)題，于是拋棄之。首先，立春紅〔也包括考染膠〕的靈敏度和HRP-ECLWB結(jié)果會(huì)不會(huì)失敗〔考染膠無(wú)顏色也不能說(shuō)明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染〕，你照舊得連續(xù)后面的操作；不承受更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時(shí)轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白〔固定marker的上樣量格外必要〕。固然上面提到針對(duì)PVDF膜，由于對(duì)小分子截留的局限，顏料分子會(huì)在高強(qiáng)度的轉(zhuǎn)印過(guò)程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過(guò)〔顏料與蛋白交聯(lián)得過(guò)深會(huì)使整個(gè)lane糊掉；太緊〔多〕可轉(zhuǎn)變蛋白構(gòu)象使遷移率轉(zhuǎn)變。所以多數(shù)狀況下顏料和蛋白之被結(jié)實(shí)的截留在膜上NC膜；要率的指示，而把預(yù)染的marker僅僅作為一個(gè)分子量大小的指針，固然同時(shí)可確認(rèn)之前的轉(zhuǎn)膜操作無(wú)誤〔〕，也可為后續(xù)抗體孵育操作時(shí)膜的正反面做必要的提示。不同公司預(yù)染的marker效果不太一樣，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù)染marker8-10ul，MBI5ul〔20×30cm〕，Biorad－mini3型〔8.2×7.4cm)MBI最2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清楚。抗體孵育——WB真正的難點(diǎn)：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個(gè)脾氣。對(duì)WB結(jié)果有打算性影響的因素是抗體的效價(jià)和假設(shè)正確使用手中的抗體。無(wú)論你如何提高的最大化。封閉最短可以縮減到5min：很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實(shí)這也是沒(méi)有吃透WB〔說(shuō)實(shí)話，常?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，格外的無(wú)語(yǔ)〕；實(shí)際上封閉〔極端點(diǎn)〕也是個(gè)可有可無(wú)的步本不用封閉也可以有較低的背景；假設(shè)抗體很，其實(shí)封閉最短可以縮減到5min〔沒(méi)試過(guò)更短的，不愿定不行以〕。那什么導(dǎo)致高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好〔主因〕，或〔增大抗體稀釋比略微有所改善釋液一樣，也可以不同；通常封閉液是最簡(jiǎn)潔〔單方〕的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。封閉很少出狀況。不過(guò)在milk做封閉劑的封閉液中，milk顆粒未完全溶解時(shí)，微小的顆粒會(huì)粘附在膜上增加星點(diǎn)狀背景。緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗?？贵w孵育成敗的關(guān)鍵首要在抗體本身抗體中質(zhì)量問(wèn)題最嚴(yán)峻的是scbt的抗體，但它們的價(jià)格卻是最廉價(jià)的。其實(shí)，scbt在美國(guó)的〔你指定的他們銷(xiāo)售的另外一種抗體ProAbeads之類(lèi)的，所以不驚異它的普及率；也正由于此，假設(shè)你參考文獻(xiàn)的話很簡(jiǎn)潔找到這家公司的。惋惜，在國(guó)內(nèi)更推舉sigma和AbcoR&DSigma公司銷(xiāo)售的Acticat.A531cloneAC-7，Mab更是作為手練習(xí)專(zhuān)用的抗體；它的背景很低，效價(jià)很高，可以1：30,000稀釋〔是一般一30倍〕。此外，盡管cellsignaling是做磷酸化抗體起家的公司，但它們的抗體的質(zhì)量總體感覺(jué)也不好，所以有其它公司可以選擇時(shí)，我們會(huì)刻意避開(kāi)購(gòu)置cellsignaling的產(chǎn)品，諸如Akt總抗和Ser473〔這兩種抗體R&D的產(chǎn)品效價(jià)不錯(cuò)〕?！蔡貏e注明：前幾年CSTAKT55KDa左右，而其他公司均認(rèn)定為60KDaAKT〔包括磷酸化〕已經(jīng)被CST自己下架了，從目前的幾個(gè)抗體示意圖看，大小也已與其他公司全都；因此，要不要買(mǎi)取決你自己〕A.的圖例。B.不給內(nèi)源性蛋白標(biāo)記的圖示，用IP的樣品取代。通過(guò)IP可以富集抗原，削減雜蛋C.用制備抗體時(shí)高表達(dá)的多肽做陽(yáng)性樣品，不給全長(zhǎng)蛋白的圖例。由于多肽可以IP富集，且不存在空間折疊的問(wèn)題〔通常暴露在外〕，因此很簡(jiǎn)潔標(biāo)記。除以上把戲外，不少抗體用途上還有局限，因此選擇抗體時(shí)要睜大眼睛。此外，有一點(diǎn)值得留意的是，scbt銷(xiāo)售的抗體外表上很多〔1ml，而別的公司通常是200ul或者100ul〕，0.2λ，所以實(shí)際上他們抗體的質(zhì)量也和其他公司的沒(méi)區(qū)分都是200ug〔常規(guī)〕〔稀釋的一抗〕1ug/ml時(shí)，scbt1：200。不過(guò)近來(lái)覺(jué)察，實(shí)際上他們的抗體1:2K稀釋效價(jià)也不錯(cuò)，因此或許其他公司的一抗可以進(jìn)一步提高稀釋比?，F(xiàn)在推斷當(dāng)時(shí)scbt抗體之所以承受1:200稀釋?zhuān)瑢?shí)際上是由于自制的ECL不夠靈敏，所以建議用靈敏性更好的ECL，這樣可以削減抗體的消耗量，進(jìn)一步降低試驗(yàn)本錢(qián)。41-1.5hrs1:5K0.5-1hr〔過(guò)久并〔相當(dāng)于洗膜異熒光信號(hào)強(qiáng)度間的比照。孵育時(shí)間過(guò)久還會(huì)迫使你延長(zhǎng)TBST的時(shí)間，這對(duì)抗原識(shí)別力氣較弱的抗體更致命〕。洗膜通常用TBST，也可以考慮高鹽洗膜液〔NaCl0.5M〕；洗膜時(shí)間一般10min*3或者5min*4?？贵w孵育和洗膜時(shí)，搖床速度不能過(guò)快也不宜過(guò)慢，需要簡(jiǎn)潔摸索一下。聊完以上那些淺顯的根本常識(shí)，接下來(lái)談我認(rèn)為最麻煩的：——性抗體與非特異性?抗體?〔不好描述，指添加在抗體稀釋液中的封閉蛋白，我們可以把它們看成非特異性的一抗201以上，在碰撞幾率一樣的條件下〔特異性一抗積存了識(shí)別、結(jié)合優(yōu)勢(shì)。同樣在TBST等漂洗的狀況下，由于親和力等緣由，使得一抗很牢靠并進(jìn)一步增加比照優(yōu)勢(shì)，再經(jīng)過(guò)2抗特異性積存和ECL的最終放大形成特異性條帶和非特異性背景之間熒光信號(hào)的巨大差異。由以上碰撞結(jié)合、親和力差異這些根本現(xiàn)象，我們可以解釋W(xué)B中消滅的現(xiàn)象。1.PBS漂洗去培育基中BSA，是在BSA位置任何抗體都可以非特異性的結(jié)合從而顯影。用碰撞的原理去解釋?zhuān)寒?dāng)雜帶很帶濃，碰撞幾率大，粘附一抗的時(shí)機(jī)多，因此它就會(huì)顯出來(lái)，但切記這是雜帶。當(dāng)雜蛋白含量高到確定程度，“任何”一種一抗都可以在該位置顯出條帶。因此，用條帶的深淺去推斷是否是靶蛋白，這是格外不科學(xué)的。在默認(rèn)抗體有效的狀況下，表達(dá)或IP純化的樣品做陽(yáng)性比照，或者KD該蛋白的樣品做陰性比照一起電泳轉(zhuǎn)膜，才能準(zhǔn)確區(qū)分靶蛋白和雜質(zhì)?！灿肐P或KD樣品也是驗(yàn)證商品化抗體是否有效的牢靠方案〕2.WB結(jié)果白板〔無(wú)信號(hào)〕和黑板〔高背景〕。從抗體孵育角度解釋白板和黑板問(wèn)題〔固然也可能與ECL顯影有關(guān)，此點(diǎn)下一節(jié)有闡述〕，白板主要是可能是抗體本身效價(jià)不高，或者非特異性背景同樣結(jié)合強(qiáng)度——中封閉蛋白的拮抗作用又沒(méi)有完全發(fā)揮膜的任何位置，顯影后整張膜全黑。非特異性結(jié)合的信號(hào)差異，降低背景?！斑@點(diǎn)格外重要”——當(dāng)你的抗體標(biāo)不到抗原時(shí)〔白板〕，先弄出條帶〔黑板〕，再解決黑板〔高背景〕問(wèn)題。第一步應(yīng)當(dāng)是通過(guò)倍比降低一抗的稀釋比〔從1:1K降到1:500到1:250WB結(jié)果不會(huì)有太明顯的轉(zhuǎn)變〕，司生產(chǎn)的抗體。那么如何通過(guò)轉(zhuǎn)變抗體稀釋液的配方，尋求抗體孵育的最正確條件呢？首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒(méi)有一個(gè)確定通用的配方；一種抗體一個(gè)脾氣。兩方面的平衡。milBSA和gelati?？墒牵阌袥](méi)有考慮過(guò)“復(fù)方”？——這下配方無(wú)限多了吧。milk，BSAgelatin的單方。3%milk，5%BSA，<=0.4%gelatin，并依據(jù)實(shí)際狀況轉(zhuǎn)變〔假設(shè)消滅白板，請(qǐng)降低封閉劑濃度。；黑板多加〕。gelatin大家可能比較生疏，不過(guò)假設(shè)你翻翻抗體公司賣(mài)給你的原裝抗體里面液體的配方它?；旌?。不過(guò)有些細(xì)節(jié)還是要自己摸索的，比方gelatin＋BSA時(shí)，gelatin濃度不能無(wú)限提高〔會(huì)完全競(jìng)爭(zhēng)掉抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致白板〕，BSA的濃度較任憑。抗體稀釋液可用低鹽濃度的但是切記，有的抗體對(duì)鹽濃度敏感，包括構(gòu)象和溶解度，因此需要嘗試。假設(shè)以上策略照舊無(wú)法解決高背景membrane的邊角料〔的〕放在一起孵育個(gè)把小時(shí)再用。假設(shè)還不行，徹底無(wú)解，結(jié)論抗體太差；請(qǐng)更換別的公司或者抗別的區(qū)段的同種抗體。這三種封閉蛋白的差異：milk和gelatinmilkmilk脫脂不充分亦〔原抗體結(jié)合或者小的蛋白。通常，我會(huì)將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過(guò)程中，不溶的gelatin會(huì)漸漸溶解；由于gelatin可以滅菌〔milk不行以〕，所以同樣條件下，gelatin的存放時(shí)間明顯長(zhǎng)于milk〔月以上；對(duì)于老手用過(guò)2、3次的舊抗體更prefer，因此背景降到很低而效價(jià)正是最高的時(shí)候〕的沉淀在底部，更長(zhǎng)時(shí)間還會(huì)有異味。稀釋的一抗靠添加NaN3并于4度保存延長(zhǎng)使用時(shí)NaN3，但放在-20〔只是高濃度的原始管抗體的凍融對(duì)效價(jià)會(huì)有較大影響〕。抗體稀釋液〔一抗、二抗稀釋液也可同也可不同〕和封閉液可以一樣，可以不同，由于抗體閉液用milk時(shí)，gelatin稀釋的一抗混入少許milk會(huì)影響其使用壽命。由于以上諸多可變因素，實(shí)在無(wú)法總結(jié)出一種萬(wàn)金油式的抗體稀釋液〔只能是多數(shù)通用〕，因此對(duì)待具體問(wèn)題時(shí)，請(qǐng)具體對(duì)待〔多花點(diǎn)心思摸索吧〕。原裝抗體的保存：分裝。每次一管，但是可能太多占地方，而且還會(huì)有粘壁的損失，不是很推舉。1：1加甘油，凍于-20度，可長(zhǎng)期保存，此方法實(shí)際上也被很多國(guó)內(nèi)的試劑公司廣泛承受，諸如博士得，中杉，它們小包裝的進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保存于-20〔不信去查查〕1：1說(shuō)明書(shū)中本身存在甘油，或特別注明外，通常可以承受。顯影——淬滅的禍因當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗完畢后，進(jìn)入ECL顯影步驟。固然，目前國(guó)內(nèi)一些試驗(yàn)室已經(jīng)換ECL和常規(guī)的底片顯影都省略了，因此以下所爭(zhēng)論的某些細(xì)節(jié)問(wèn)題可能不再消滅。首先壇子上還有少數(shù)試驗(yàn)室處于DAB顯色時(shí)代，奉勸一句，都走到最終一步了就不要節(jié)約了；DAB顯色的靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前較為流行的仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡(jiǎn)述一下其原理：交聯(lián)在二抗上的HRP酶能夠特異水解過(guò)氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL劑和中間遞質(zhì)〔白色瓶子主要是過(guò)氧化物如雙氧水〕質(zhì)主要是吸取化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類(lèi)的化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。因此催化劑的效率和中間遞質(zhì)的傳遞效率直接影響熒光的強(qiáng)弱。本人曾自制過(guò)ECL并嘗試改進(jìn)，其間覺(jué)察很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依靠于HRP濃度，熒光信號(hào)能瞬間曝強(qiáng)；這其實(shí)與下文提到的一些粹滅緣由有聯(lián)系。當(dāng)時(shí)我自制的ECLECL同樣也有保質(zhì)期的問(wèn)題，往往最先失效的組分就是過(guò)氧化物，盡管他們必定添加過(guò)抗復(fù)原劑。其實(shí)，檢驗(yàn)ECL是否失效的方法很簡(jiǎn)潔，取稀釋的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀看熒光強(qiáng)度，即可知道ECL是否失效。商品化的ECL價(jià)格并不廉價(jià)，因此ECL孵育的最正確方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或干凈的支持物上，如廢棄的舊底片、塑料盒，有機(jī)玻璃盒等等〔留意，國(guó)產(chǎn)的保鮮膜很多質(zhì)量不過(guò)關(guān)，有兩種潛在的問(wèn)題，下面詳述〕，然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個(gè)角來(lái)回拖動(dòng)數(shù)次至ECL均勻〔有的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求孵育1min〕。另外平鋪一張干凈的保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini3型膠整張膜孵育，ECL0.7-1ml足矣。哪些因素會(huì)影響熒光信號(hào)的強(qiáng)弱呢？〔這局部實(shí)際上與導(dǎo)致熒光淬滅的因素局部重合〕保鮮膜的質(zhì)量。a.國(guó)產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價(jià)格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上簡(jiǎn)潔從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反響不充分，另一方面ECL所含液體會(huì)溶解試驗(yàn)臺(tái)上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒〔或許你或其他人曾經(jīng)不留神打翻過(guò)某種化合物〕、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡(jiǎn)述原理時(shí)，我曾經(jīng)提到過(guò)很多化合物、金屬離子能直接催化過(guò)氧化物水解，在極短的時(shí)間內(nèi)消耗掉全部的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。保鮮膜的化工原料或拉制過(guò)程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價(jià)的保鮮膜問(wèn)題尤多。目前，國(guó)產(chǎn)的就“妙潔”比較過(guò)關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。假設(shè)買(mǎi)不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別留意這些支持物外表的干凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。ECL孵育完畢后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過(guò)水會(huì)吸取光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會(huì)干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育完畢時(shí)需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請(qǐng)留意不能讓膜完全干掉。某些信號(hào)較弱的ECL，膜徹底干掉后熒光會(huì)消逝；較好的試劑盒，熒光相對(duì)穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會(huì)上升，而且會(huì)嚴(yán)峻影響ECL被吸走就好。3.控干的膜要認(rèn)真用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時(shí)，包裹保鮮膜時(shí)要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間消滅皺褶。皺褶的地方會(huì)積存多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸取熒光或者局部區(qū)域HRP過(guò)度消耗，呈線條狀淬滅。4.問(wèn)題。很多人提問(wèn)觀看很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒(méi)有信號(hào)，那么就是快速淬滅〔閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種狀況下的熒光信號(hào)〕造成的；有這個(gè)觀看至少能夠推斷ECL簡(jiǎn)潔了，由于之前任何操作都可能導(dǎo)致白板，根本無(wú)法推斷。除上述的問(wèn)題以外，還有哪些因素會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅呢？抗原濃度太高，熒光信號(hào)過(guò)強(qiáng)，快速淬滅。在電泳的章節(jié)就曾提過(guò)，假設(shè)上樣量太大，不僅條帶會(huì)粘連、彎曲，更可能導(dǎo)致淬滅。由于局部區(qū)域過(guò)多的HRP酶會(huì)快速消耗底物呈〔取出膜會(huì)覺(jué)察一條明顯的暗黃色的帶〕，熒光信號(hào)會(huì)閃滅或者條帶空心〔條帶灰黑不實(shí)，則可能是顯影液接近失效〕?？乖瓭舛忍?，熒光信號(hào)太弱，相對(duì)慢一點(diǎn)的淬滅?？赡艿谝淮螇浩軌颢@得很弱的條帶，隨后都不行見(jiàn)。ECL試劑質(zhì)量。除過(guò)氧化物因接觸空氣被漸漸復(fù)原外，ECL的成分通常都不穩(wěn)定。如呈遞電子躍遷能的中間遞質(zhì)其化學(xué)性質(zhì)就不太穩(wěn)定中間態(tài)的化合物，長(zhǎng)期接觸空氣會(huì)被漸漸氧化失效；luminol也有保質(zhì)期。操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，膜漸漸徹底干掉。商品化的ECL會(huì)消滅波形漸變，開(kāi)頭信號(hào)漸漸增加，背景一起上升；隨后熒光完全衰減淬滅。不良的試驗(yàn)習(xí)慣。壇子上曾經(jīng)有人問(wèn)及淬滅問(wèn)題，提到顯影夾子很臟。臟的顯影夾主要有兩種污染，鐵銹和不慎沾染的顯影液、定影液，前者造成閃滅〔催化作用〕，后者可能直接〔其實(shí)通常還真的不嚴(yán)實(shí)，由于你不行能包裹好幾層〕。于是，我問(wèn)他用一個(gè)很臟的東西不覺(jué)得很別扭嘛，為什么不先抄起抹布擦干凈再用呢。淬滅的假象。少量沾在膜外表的二抗也會(huì)激發(fā)熒光，但ECL孵育時(shí)略微晃動(dòng)就消逝了，可能產(chǎn)生淬滅的錯(cuò)覺(jué)。Stirpping：完整的WB“可能”需要對(duì)膜stripping。這里用了“可能”二字，即不愿定必需，那么首先爭(zhēng)論一下stripping的必要性。Stripping排解其他的不講，整個(gè)流程會(huì)消耗不少的時(shí)間，從節(jié)約時(shí)間的角度來(lái)講能不做最好；并且stripping條件過(guò)于猛烈或多輪洗脫時(shí)，還會(huì)剝離已轉(zhuǎn)印到膜外表的抗原使WB的最終信號(hào)減弱；此外，strippingbuffer未去除干凈時(shí)，其中的某些組分確定會(huì)干擾其次種抗體的結(jié)合。那么在什么條件下不需要stripping呢？A蛋白和B5KDa以上〔10KDa左右更保險(xiǎn)〕，可將膜分割開(kāi)〔分別標(biāo)記不同的抗體〕，這樣就不需要stripping膜重標(biāo)記，且一次就能得到想要的結(jié)果。有人會(huì)將兩種抗體混在一起標(biāo)記整張膜各自的雜帶都不會(huì)干擾目的蛋白才可以如此操作；并且這樣的抗體下次使用有了局限性，因此不太推舉。兩種抗體種屬來(lái)源不同時(shí)，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置格外靠近無(wú)法切膜，這時(shí)候也不愿定需要stripping。輪番標(biāo)記這兩種不同的抗體時(shí)，只需要用TBST涮掉外表的ECL，時(shí)間可長(zhǎng)〔一時(shí)騰不出手來(lái)就扔在那邊始終漂，中間可以換換液〕可短〔換液涮兩三次〕，然后直接用其次種抗體標(biāo)記同一張膜。不過(guò)，假設(shè)其中一種蛋白顯影太強(qiáng)，隔天顯其次〔可能強(qiáng)可能弱了，可以在最終作圖時(shí)用PS切出來(lái)。當(dāng)兩種抗體種屬來(lái)源一樣時(shí)，有一種狀況也不需stripping，諸如標(biāo)記某蛋白的磷酸化〔相對(duì)于總蛋白而言此時(shí)也僅需簡(jiǎn)潔的漂洗；但標(biāo)記的挨次確定是先標(biāo)磷酸化后標(biāo)總蛋白。以上避開(kāi)stripping主要從節(jié)約時(shí)間的因素考慮，實(shí)際上當(dāng)上述2、3點(diǎn)存在時(shí)，個(gè)人還是會(huì)strippingbuffer簡(jiǎn)潔漂一下，然后用TBST3次再上其次種抗體；但假設(shè)時(shí)間較緊，就會(huì)真的省略。Stripping膜至少有三種方法：用TBST始終洗膜，洗8hrs以上就可以去除多數(shù)蛋白的信號(hào)，信號(hào)過(guò)強(qiáng)的蛋白如內(nèi)參stripping，的信號(hào)不會(huì)消滅，原來(lái)的信號(hào)也會(huì)被漂洗干凈，消滅白板。請(qǐng)參考milliporePVDF膜附送的說(shuō)明書(shū)配方〔沒(méi)有，請(qǐng)Google〕，上面提到假設(shè)信號(hào)很強(qiáng)，可以在50度反響。需要提示的是，由于巰基乙醇亦揮發(fā)，可以考慮臨時(shí)添加。C．假設(shè)做過(guò)IP，你就知道可以用低pHGlycine-HClbeads上特異性吸附的蛋白。同理，0.1MGlycine〔pH2.5,30min〕也可以用于stripping膜，這是最廉價(jià)的高效洗膜方案。而且經(jīng)過(guò)TBST〔10min*3〕漂洗后，膜上的pH早就恢復(fù)到正常值，此時(shí)不存在上述strippingbuffer殘留成分干擾其次種抗體標(biāo)記的狀況。假設(shè)第一種蛋白信號(hào)過(guò)強(qiáng)，同樣可以50stripping提高洗膜強(qiáng)度。此外，膜風(fēng)干后，外表結(jié)合的二抗也會(huì)脫落，不過(guò)不是很推舉。看完stripping這個(gè)局部，再多想一層，你確定會(huì)找到同一張膜屢次標(biāo)記不同抗體的竅門(mén)。假設(shè)有A、B、C三種蛋白，因分子量過(guò)于接近無(wú)法切膜：假設(shè)BCA-C-B或者B-C-。A、B、C的抗體同種來(lái)源，A、B幾乎在一起，條帶粘連；C靠下。假設(shè)A、B重要性差BB-C-AABA-C-B。由于，經(jīng)過(guò)兩次strippingbuffer洗脫，且兩輪WB8hrs〔4度過(guò)夜孵育〕，實(shí)際上在標(biāo)記第三種抗體時(shí)，相對(duì)于經(jīng)受了3次不同強(qiáng)度的stripping；不要擔(dān)憂第一種抗體還會(huì)有很強(qiáng)的干擾。如何正確使用QuantiyOne定量：〔以下文字系摘錄+改寫(xiě)整合〕WBBiorad公司的QuantiyOne軟件莫屬，然而其$6K左右的售價(jià)令很多人望而卻步；不過(guò)，這款軟件之所以敢如此功能滲透了艱深的數(shù)理理論以及概率統(tǒng)計(jì)的原理“免費(fèi)”軟件在使用著——暴殄天物。目前多數(shù)免費(fèi)軟件主要承受的是等高線定量法〔VolumnContour〕，QuantiyOne也包含這局部?jī)?nèi)容且在網(wǎng)絡(luò)教程里面流傳最廣，以至于很多人只會(huì)這種并不準(zhǔn)確的蛋白定量方法。等高線定量法通過(guò)半自動(dòng)描繪電泳條帶的等高線邊緣來(lái)得到等高線區(qū)域內(nèi)部面積“半自動(dòng)”狀態(tài)，即需要人為判斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的邊緣法繪制單一條帶的輪廓〔常消滅連續(xù)的幾個(gè)條帶等高線相連而無(wú)法分別出單獨(dú)條帶的輪廓〕。/條帶軌跡定量法〔TraceTracking〕。這種---電泳條帶識(shí)別這兩個(gè)連續(xù)的步驟才能進(jìn)行定量。但它最大優(yōu)點(diǎn)在于可以完全拋棄人為主觀因素進(jìn)展全自動(dòng)定量。他的定量方式為：首先依據(jù)不同電泳條帶的光密度值繪制光密度曲線電泳條帶在一條幾乎一樣的起跑線上進(jìn)展比照終，承受泳道/條帶軌跡定量法分析條帶光密度后，再結(jié)合GaussModelBands對(duì)電泳條帶進(jìn)展數(shù)理統(tǒng)計(jì)。執(zhí)行步驟：QuantiyOne只能識(shí)別黑白的TIF文件，而實(shí)際上發(fā)表論文時(shí)，很多雜志也要求供給TIF等格式的圖片而非JEPG格式的；因此，考慮到這兩層因素，我建議大家從一開(kāi)頭掃描就統(tǒng)一存貯為T(mén)IF格式的圖片。創(chuàng)立泳道：翻開(kāi)我們要分析的電泳圖片〔以蛋白質(zhì)電泳為例〕。。這時(shí)假設(shè)您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話，QuantityOne就會(huì)自動(dòng)識(shí)別出每條電泳泳道的位置，而且將各個(gè)泳道的路徑用一條紅線標(biāo)畫(huà)出來(lái)；假設(shè)您對(duì)軟件自動(dòng)標(biāo)記的泳道不甚滿足，您可以通過(guò)“Lane-EditFrame”下級(jí)各個(gè)子菜單供給的功能對(duì)泳道框架位置、大小等進(jìn)展調(diào)整；調(diào)整方法就是通過(guò)鼠標(biāo)的拖放來(lái)實(shí)現(xiàn)。假設(shè)您只需要分析其中幾個(gè)泳道的數(shù)據(jù)而不想其他泳道的標(biāo)記干擾您的視線，您可以通過(guò)“Lane-SingleLane-RemoveLane”刪除您不需要的泳道的標(biāo)記。留意：不是全部的電泳圖片的泳道都能夠被QuantityOne自動(dòng)識(shí)別。在不能自動(dòng)識(shí)別的狀況下，QuantityOne就會(huì)彈出對(duì)話框告知您它不能識(shí)別泳道方法和上面一樣，同過(guò)“Lane-SingleLane-CreatLane”來(lái)實(shí)現(xiàn)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標(biāo)記紅線。不同泳道的背景排解：擇“Lane-LaneBackgroud...”命令。選擇該命令后，鼠標(biāo)即變成一個(gè)綠色的“+”，將鼠標(biāo)移到您打算進(jìn)展背景排解的泳道，點(diǎn)擊左鍵一下，馬上就會(huì)彈出如以以下圖所示的對(duì)話框。其中“OpticalDensity”顯示得是該泳道光密度值的分布狀況。大家會(huì)留意到這個(gè)分布曲線并“懸空現(xiàn)象”的緣由就是該泳道自身存在著確定的光密度“背景”。這個(gè)背景的存在導(dǎo)致該泳道上各個(gè)電泳條帶之間不能處于同一水平“LaneBackgroudSubstruction”對(duì)話框。這個(gè)對(duì)話框的上方“AllLanes”表示可以對(duì)全部泳道進(jìn)展一次性處理；下方的“SelectedLane”表示僅針對(duì)此次選中的這個(gè)泳道進(jìn)展處理。我們用鼠標(biāo)選擇“SelectedLane”的“LaneOn”選項(xiàng)。然后在下面的“RollingDiskSize”里填上“5”，再按“回車(chē)”鍵。大家再來(lái)看看現(xiàn)在“OpticalDensity”中消滅了一條緊緊沿著光密度曲線分布的醬色曲線。這條曲線將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布格外準(zhǔn)確的劃分開(kāi)來(lái)。留意：“RollingDiskSize”是什么意思呢？實(shí)際上就是數(shù)理里面的微分等差靠近。我們可以將QuantityOne供給的去除背景功能想象成是一個(gè)滾動(dòng)的小球。假設(shè)這個(gè)小球的半徑越小，那么它沿著光密度曲線滾動(dòng)時(shí)滾過(guò)的路徑就更加精細(xì)黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來(lái)說(shuō)“RollingDiskSize”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可以試著選擇一個(gè)較大的值比方80，再來(lái)看看此時(shí)醬色曲線的軌跡。度曲線內(nèi)部，造成有效陽(yáng)性信號(hào)的損失。個(gè)人感覺(jué)5~20是一個(gè)比較好的取值范圍。我們可以對(duì)每條泳道依葫蘆畫(huà)瓢進(jìn)展以上類(lèi)似的背景排解工作以使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即一樣的“RollingDiskSize”進(jìn)展排解，那么我們可以在“LaneBackgroudSubstruction”對(duì)話框中選擇上方的“AllLanesOn(samelevel)”選項(xiàng)。然后在“RollingDiskSize”中填上一個(gè)適宜的值，點(diǎn)擊“Done”按鈕確認(rèn)就可以了。此時(shí)該電泳圖片上全部的泳道都以一樣的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展了背景去除。創(chuàng)立條帶：里明確兩個(gè)名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band”指電泳條帶〔在下文中一律使用這兩個(gè)英文名詞來(lái)表示這兩個(gè)意思〕。電泳條帶的識(shí)別：和前面爭(zhēng)論Lane一樣，首先我們要對(duì)Lane上的Band進(jìn)展識(shí)別。識(shí)別方式同樣分為自動(dòng)識(shí)別和人工識(shí)別。自動(dòng)識(shí)別的時(shí)候選擇“Band-DetectBands...”命令。QuantityOne會(huì)自動(dòng)彈出一個(gè)“DetectBands”的對(duì)話框。留意：第一次用QuantityOne時(shí)，您的Bands識(shí)別以后僅僅是畫(huà)出了一條紅色的粗線，而在上面的演示圖片中卻是上下括號(hào)的形式。其實(shí)大家可以在“Band-BandAttributes”選項(xiàng)中設(shè)置Bands的顯示形式。在下方的“Style”選項(xiàng)卡中選擇“Brackets”就會(huì)將原來(lái)的粗線改為括號(hào)形式了。假設(shè)要自動(dòng)識(shí)別全部Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All”選項(xiàng)；假設(shè)僅僅想自動(dòng)識(shí)別某一條Lane上的Bands就鉤選“One”，然后在后面的輸入框中填上您想識(shí)別的泳道號(hào)碼；假設(shè)僅僅想識(shí)別泳道上局部光密度值最強(qiáng)的Bands，可以在“Bands”后面的選項(xiàng)中選擇“Limit”，然后填上相應(yīng)的數(shù)目〔比方10〕。QuantityOne就會(huì)僅識(shí)別該泳道上光密度最大10條Bands；假設(shè)您覺(jué)察自動(dòng)識(shí)別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號(hào)內(nèi)范圍小于黑色的光密度影。此時(shí)可以使用“LaneWidth”Bands識(shí)別的寬度。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“LaneWidth”Band影跡；假設(shè)您覺(jué)察自動(dòng)識(shí)別功能沒(méi)有識(shí)別您想要的Band或者誤識(shí)別了您不想要的Band，您還可以使用上面的工具欄進(jìn)展“添加”或“刪除”。將您的鼠標(biāo)指向每個(gè)圖標(biāo)，QuantityOne就會(huì)知道彈出一個(gè)黃色的提示信息告知您這個(gè)按鈕的功能。高斯建模與結(jié)果分析：高斯建模，即用數(shù)學(xué)方法〔微積分〕對(duì)正態(tài)分布曲線進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。理論上每道band的光密度都呈正態(tài)分布的平滑曲線〔每個(gè)band中間位置蛋白壓縮最緊濃度最高，向上向下因集中而減弱〕；然而實(shí)際操作過(guò)程中，假設(shè)熒光過(guò)強(qiáng)，往往消滅類(lèi)似方波的曲線〔曲線無(wú)peak峰，上方為平滑直線，超識(shí)別的最高閾值〕；熒光較弱宜消滅波浪樣〔多〕波峰，或難與背景區(qū)分。首先電腦會(huì)統(tǒng)計(jì)band中每個(gè)點(diǎn)的光密度值，并對(duì)這些值按正態(tài)分布進(jìn)展歸類(lèi)，當(dāng)讀值不符〔置信區(qū)間〕，從而最終優(yōu)化光密度曲線呈正態(tài)分布。如何進(jìn)展高斯建模呢？很簡(jiǎn)潔，只要執(zhí)行“Band-GaussModelBands...”命令就可以了，執(zhí)行后QuantityOne“One”，然后“All”模這么多泳道會(huì)費(fèi)一點(diǎn)時(shí)間了。觀看結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后使用“Band-BandInformation”命令來(lái)觀看結(jié)果。方法是將變成藍(lán)色贊美號(hào)的鼠標(biāo)移到剛剛已經(jīng)識(shí)別的Band的部位，一個(gè)具體的“BandInformation”信息框就會(huì)馬上彈出來(lái)。在這幅圖中我們必需留意的是“Trace”和/或“GaussModel光密度分布曲線下面積，也就是QuantityOne用來(lái)表達(dá)Band內(nèi)分子總量的方式。最終，我們計(jì)算、記錄的值，應(yīng)當(dāng)是“GaussModelTrace”這一欄的讀值。Stirpping：完整的WB“可能”需要對(duì)膜stripping。這里用了“可能”二字，即不愿定必需，那么首先爭(zhēng)論一下stripping的必要性。Stripping排解其他的不講，整個(gè)流程會(huì)消耗不少的時(shí)間，從節(jié)約時(shí)間的角度來(lái)講能不做最好；并且stripping條件過(guò)于猛烈或多輪洗脫時(shí)，還會(huì)剝離已轉(zhuǎn)印到膜外表的抗原使WB的最終信號(hào)減弱；此外，strippingbuffer未去除干凈時(shí)，其中的某些組分確定會(huì)干擾其次種抗體的結(jié)合。那么在什么條件下不需要stripping呢？A蛋白和B5KDa以上〔10KDa左右更保險(xiǎn)〕，可將膜分割開(kāi)〔分別標(biāo)記不同的抗體〕，這樣就不需要stripping膜重標(biāo)記，且一次就能得到想要的結(jié)果。有人會(huì)將兩種抗體混在一起標(biāo)記整張膜且各自的雜帶都不會(huì)干擾目的蛋白才可以如此操作；并且這樣的抗體下次使用有了局限性，因此不太推舉。兩種抗體種屬來(lái)源不同時(shí)，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置格外靠近無(wú)法切膜，這時(shí)候也不愿定需要stripping。輪番標(biāo)記這兩種不同的抗體時(shí)，只需要用TBST涮掉外表的ECL，時(shí)間可長(zhǎng)〔一時(shí)騰不出手來(lái)就扔在那邊始終漂，中間可以換換液〕可短〔換液涮兩三次〕，然后直接用其次種抗體標(biāo)記同一張膜。不過(guò)，假設(shè)其中一種蛋白顯影太強(qiáng)，隔天顯其次〔可能強(qiáng)可能弱了，可以在最終作圖時(shí)用PS切出來(lái)。當(dāng)兩種抗體種屬來(lái)源一樣時(shí)，有一種狀況也不需stripping，諸如標(biāo)記某蛋白的磷酸化〔相對(duì)于總蛋白而言此時(shí)也僅需簡(jiǎn)潔的漂洗；但標(biāo)記的挨次確定是先標(biāo)磷酸化后標(biāo)總蛋白。以上避開(kāi)stripping主要從節(jié)約時(shí)間的因素考慮，實(shí)際上當(dāng)上述2、3點(diǎn)存在時(shí)，個(gè)人還是會(huì)strippingbuffer簡(jiǎn)潔漂一下，然后用TBST3次再上其次種抗體；但假設(shè)時(shí)間較緊，就會(huì)真的省略。Stripping膜至少有三種方法：用TBST始終洗膜，洗8hrs以上就可以去除多數(shù)蛋白的信號(hào)，信號(hào)過(guò)強(qiáng)的蛋白如內(nèi)參stripping，的信號(hào)不會(huì)消滅，原來(lái)的信號(hào)也會(huì)被漂洗干凈，消滅白板。請(qǐng)參考millipore