樣品采集和處理詳解

樣品采集和處理詳解演示文稿1當(dāng)前第1頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)優(yōu)選樣品采集和處理2當(dāng)前第2頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)基本知識(shí)

HIV檢測(cè)方法

抗體檢測(cè)、抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)、耐藥檢測(cè)、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞測(cè)定、HIV分離培養(yǎng)

樣品的種類

全血、血清、血漿、細(xì)胞、唾液、尿液、濾紙干血斑

支持性文件:《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)質(zhì)量保證指南》(2006)、《HIV-1病毒載量測(cè)定及質(zhì)量保證指南》(2008)、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號(hào)令，2006)3當(dāng)前第3頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)基本知識(shí)step4step3step2step1檢測(cè)方法樣品種類采集處理保存運(yùn)輸樣品采集處理選擇策略檢測(cè)方法：依據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康倪x擇。樣品種類：實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)試劑和儀器要求。采集處理：采血方法、抗凝管的選擇、采血量、離心分離、多項(xiàng)檢測(cè)保存運(yùn)輸：溫度、時(shí)限、容器4當(dāng)前第4頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)樣品種類

HIV抗體檢測(cè)：全血、血清、血漿、唾液、尿液、DBS

CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞測(cè)定：抗凝全血

病毒載量檢測(cè)：血漿

耐藥、基因型檢測(cè)：血漿、DBS核酸定性檢測(cè)：全血、血漿、淋巴細(xì)胞、DBS分離培養(yǎng)：全血、淋巴細(xì)胞5當(dāng)前第5頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)抗病毒治療的目標(biāo)病毒學(xué)目標(biāo)：最大程度地減少病毒載量，將其維持在不可檢測(cè)水平的時(shí)間越長(zhǎng)越好免疫學(xué)目標(biāo)：維持免疫功能，獲得免疫功能重建和/或部分免疫重建終極目標(biāo)：延長(zhǎng)生命并提高生活質(zhì)量6當(dāng)前第6頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量與CD4+T計(jì)數(shù)

HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996AIDS病程：一列迫近懸崖的列車病毒載量=火車的速度CD4+T計(jì)數(shù)=離懸崖的距離抗病毒治療：制動(dòng)火車的外力7當(dāng)前第7頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量與CD4+T計(jì)數(shù)8當(dāng)前第8頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量與CD4+T計(jì)數(shù)

CD4細(xì)胞(cell/mm3）800400

急性感染期

無(wú)癥狀期

艾滋病前期和艾滋病期

CD4

病毒載量抗HIV的CTLHIV抗體9當(dāng)前第9頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)HAART的目標(biāo)UltimateGoalofHAARTRelativeLevelsMonthsYearsAfterHIVInfectionCD4+T-cellsPlasmaHIVViremiaAcuteHIVinfectionSymptomLimitofdetection10當(dāng)前第10頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)HIV-1病毒載量檢測(cè)代表的是病毒的負(fù)荷，即體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量是不能直接測(cè)量的，一般用血漿中RNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量簡(jiǎn)單來(lái)講是通過(guò)測(cè)量從而顯示每毫升血液里病毒的數(shù)量定量機(jī)體內(nèi)游離病毒的含量11當(dāng)前第11頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量檢測(cè)的意義急性HIV感染，窗口期復(fù)制高峰每毫升血液RNA拷貝可達(dá)9×107，一年以后仍然可達(dá)2-4×104判定病人疾病的進(jìn)程和進(jìn)展。血漿中病毒水平是病毒增殖和免疫清除機(jī)制共同作用的結(jié)果，CD4+T細(xì)胞越少顯示病毒載量水平越高12當(dāng)前第12頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量檢測(cè)的意義監(jiān)測(cè)與指導(dǎo)抗病毒治療過(guò)程，ART早期HIVRNA水平快速下降，并在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間維持在一個(gè)比較平緩的水平，大部分患者可以下降到檢測(cè)不出的水平觀察耐藥性13當(dāng)前第13頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)HIV-1病毒載量檢測(cè)方法病毒載量檢測(cè)主要有三種方法：bDNA、RT-PCR及NASBANASBA檢測(cè)是通過(guò)核酸釋放、提取、核酸擴(kuò)增(NASBA擴(kuò)增)及核酸檢測(cè)來(lái)完成對(duì)血漿中HIV病毒RNA的定量測(cè)定生物梅里埃公司將NASBA核酸擴(kuò)增技術(shù)與實(shí)驗(yàn)時(shí)(real-time)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，“分子信標(biāo)實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)”，能夠?qū)z測(cè)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，即稱為“EasyQ”14當(dāng)前第14頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量檢測(cè)樣品采集運(yùn)輸保存HIV-1，血漿樣品EDTA抗凝真空無(wú)菌采血管全血5ml或3ml*2,采集的樣品量應(yīng)盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過(guò)多或不足，會(huì)造成血液凝固或被稀釋。采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充分混勻，避免劇烈振蕩導(dǎo)致溶血15當(dāng)前第15頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量檢測(cè)樣品采集運(yùn)輸保存務(wù)必在采集全血的4小時(shí)內(nèi)分離血漿，室溫下1500-3000r/min離心15分鐘送檢血漿2管，每管>1ml，冷凍(藏)運(yùn)輸血漿樣本3天內(nèi)送檢可在2-8℃暫時(shí)保存，1個(gè)月以內(nèi)應(yīng)凍存于-20℃以下，1年以內(nèi)應(yīng)置于-70℃以下血漿樣品凍融不應(yīng)超過(guò)3次16當(dāng)前第16頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)病毒載量檢測(cè)結(jié)果的解釋單位：copies/ml檢測(cè)限：20cps/ml(0.5ml)；10cps/ml(1ml);100cps/ml(0.1ml)結(jié)果舉例：

＜20copies/ml(檢測(cè)到HIV核酸，但是低于方法檢測(cè)下限，無(wú)法定量)TND(未檢出，使用現(xiàn)有的檢測(cè)方法對(duì)本次樣本未檢測(cè)到HIV核酸)17當(dāng)前第17頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)樣品處理對(duì)病毒載量結(jié)果的影響一般地講，血漿中病毒載量水平比血清中的要高出30％～80％用EDTA抗凝劑的采血管采集全血后分離血漿樣本，其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相應(yīng)含量多10％～15％及20％～25％18當(dāng)前第18頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)樣品處理對(duì)病毒載量結(jié)果的影響采集全血后的3-6小時(shí)RNA丟失量最大，血漿樣本RNA丟失低于全血樣本。1小時(shí)以內(nèi)，EDTA抗凝管RNA丟失約10％，ACD抗凝管丟失約20％；6小時(shí)以內(nèi)，肝素抗凝管RNA丟失約30％。19當(dāng)前第19頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)樣品處理對(duì)病毒載量結(jié)果的影響血漿樣本在-20℃冰柜保存3-14個(gè)月，與起始病毒載量水平值(0月)相比，3個(gè)月時(shí)變化沒有顯著性差異；6個(gè)月后下降值明顯，有隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)病毒載量水平下降幅度越大的趨勢(shì)。在-20℃冰柜內(nèi)保存6個(gè)月，樣本病毒載量水平已不能真實(shí)反映樣本采集之初的水平，對(duì)疾病進(jìn)展和療效評(píng)價(jià)，尤其對(duì)回顧性研究已無(wú)指導(dǎo)意義。20當(dāng)前第20頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)樣品處理對(duì)病毒載量結(jié)果的影響-20℃條件下凍融3次比凍融1次HIVRNA降低約20％。許多研究者用多種檢測(cè)方法和不同人群樣本的研究結(jié)果證實(shí)，技術(shù)和生物因素對(duì)樣本RNA水平的影響是持續(xù)的和可預(yù)測(cè)的，大約在0.3-0.6log/ml之間。21當(dāng)前第21頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)CD4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定進(jìn)行性且選擇性地消耗CD4細(xì)胞是HIV感染的特征。CD4細(xì)胞減少與機(jī)會(huì)感染增高相結(jié)合并且在個(gè)體感染HIV后病情呈進(jìn)行性。CD4細(xì)胞殘余數(shù)在臨床預(yù)后治療監(jiān)測(cè)和新型抗逆轉(zhuǎn)錄病毒以及疫苗的臨床試驗(yàn)入選標(biāo)準(zhǔn)工作中是最經(jīng)常利用的實(shí)驗(yàn)室測(cè)量項(xiàng)目22當(dāng)前第22頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)CD4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定準(zhǔn)確及時(shí)地對(duì)殘留CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)，不僅是評(píng)價(jià)性試驗(yàn)，也是對(duì)存活的HIV感染者實(shí)施治療與關(guān)懷的一部分CD4細(xì)胞減少與機(jī)會(huì)感染增加和病情發(fā)展相聯(lián)系

CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)為HIV感染臨床分期、疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)、機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、抗病毒治療適應(yīng)癥選擇及療效評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)23當(dāng)前第23頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。FALSSensorLaser24當(dāng)前第24頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)單細(xì)胞的流動(dòng)的活細(xì)胞的定量的多參數(shù)的高統(tǒng)計(jì)學(xué)精度的分選細(xì)胞25當(dāng)前第25頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)CD4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定的方法CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法分為兩大類，一類是應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定法，另一類是非流式細(xì)胞儀測(cè)定法常用的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法為自動(dòng)檢測(cè)方法，包括流式細(xì)胞儀（主要有多平臺(tái)法和單平臺(tái)法）和專門的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀26當(dāng)前第26頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)雙平臺(tái)法雙平臺(tái)方法是一種細(xì)胞群體的絕對(duì)計(jì)數(shù)方法，利用血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)量，再根據(jù)流式細(xì)胞儀得到的細(xì)胞群體百分比，計(jì)算得到每微升的淋巴細(xì)胞數(shù)量。雙平臺(tái)法需要兩種儀器，由于儀器有系統(tǒng)誤差，計(jì)算結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性影響因素較多，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室計(jì)數(shù)結(jié)果差異很大。最大的缺點(diǎn)在于操作步驟復(fù)雜，操作人員多、費(fèi)時(shí)，因此很難將變異水平減小到最低。27當(dāng)前第27頁(yè)\共有29頁(yè)\編于星期四\2點(diǎn)單平臺(tái)法應(yīng)用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參絕對(duì)計(jì)數(shù)微球，加上流式細(xì)胞儀淋巴細(xì)胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細(xì)胞亞群的相對(duì)數(shù)(百分比)和絕對(duì)數(shù)。單平臺(tái)法最大程度地減少了多個(gè)儀器檢測(cè)帶來(lái)的檢測(cè)誤差，細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都得到了良好的保證。28當(dāng)前第28頁(yè)\共有2