樣品采集和處理詳解

樣品采集和處理詳解演示文稿1當前第1頁\共有29頁\編于星期四\2點優(yōu)選樣品采集和處理2當前第2頁\共有29頁\編于星期四\2點基本知識

HIV檢測方法

抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測、耐藥檢測、CD4+和CD8+T淋巴細胞測定、HIV分離培養(yǎng)

樣品的種類

全血、血清、血漿、細胞、唾液、尿液、濾紙干血斑

支持性文件:《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細胞檢測質量保證指南》(2006)、《HIV-1病毒載量測定及質量保證指南》(2008)、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號令，2006)3當前第3頁\共有29頁\編于星期四\2點基本知識step4step3step2step1檢測方法樣品種類采集處理保存運輸樣品采集處理選擇策略檢測方法：依據檢驗目的選擇。樣品種類：實驗方法、檢測試劑和儀器要求。采集處理：采血方法、抗凝管的選擇、采血量、離心分離、多項檢測保存運輸：溫度、時限、容器4當前第4頁\共有29頁\編于星期四\2點樣品種類

HIV抗體檢測：全血、血清、血漿、唾液、尿液、DBS

CD4+和CD8+T淋巴細胞測定：抗凝全血

病毒載量檢測：血漿

耐藥、基因型檢測：血漿、DBS核酸定性檢測：全血、血漿、淋巴細胞、DBS分離培養(yǎng)：全血、淋巴細胞5當前第5頁\共有29頁\編于星期四\2點抗病毒治療的目標病毒學目標：最大程度地減少病毒載量，將其維持在不可檢測水平的時間越長越好免疫學目標：維持免疫功能，獲得免疫功能重建和/或部分免疫重建終極目標：延長生命并提高生活質量6當前第6頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量與CD4+T計數(shù)

HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996AIDS病程：一列迫近懸崖的列車病毒載量=火車的速度CD4+T計數(shù)=離懸崖的距離抗病毒治療：制動火車的外力7當前第7頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量與CD4+T計數(shù)8當前第8頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量與CD4+T計數(shù)

CD4細胞(cell/mm3）800400

急性感染期

無癥狀期

艾滋病前期和艾滋病期

CD4

病毒載量抗HIV的CTLHIV抗體9當前第9頁\共有29頁\編于星期四\2點HAART的目標UltimateGoalofHAARTRelativeLevelsMonthsYearsAfterHIVInfectionCD4+T-cellsPlasmaHIVViremiaAcuteHIVinfectionSymptomLimitofdetection10當前第10頁\共有29頁\編于星期四\2點HIV-1病毒載量檢測代表的是病毒的負荷，即體內復制的病毒的數(shù)量體內復制的病毒的數(shù)量是不能直接測量的，一般用血漿中RNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量簡單來講是通過測量從而顯示每毫升血液里病毒的數(shù)量定量機體內游離病毒的含量11當前第11頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量檢測的意義急性HIV感染，窗口期復制高峰每毫升血液RNA拷貝可達9×107，一年以后仍然可達2-4×104判定病人疾病的進程和進展。血漿中病毒水平是病毒增殖和免疫清除機制共同作用的結果，CD4+T細胞越少顯示病毒載量水平越高12當前第12頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量檢測的意義監(jiān)測與指導抗病毒治療過程，ART早期HIVRNA水平快速下降，并在相當長的一段時間維持在一個比較平緩的水平，大部分患者可以下降到檢測不出的水平觀察耐藥性13當前第13頁\共有29頁\編于星期四\2點HIV-1病毒載量檢測方法病毒載量檢測主要有三種方法：bDNA、RT-PCR及NASBANASBA檢測是通過核酸釋放、提取、核酸擴增(NASBA擴增)及核酸檢測來完成對血漿中HIV病毒RNA的定量測定生物梅里埃公司將NASBA核酸擴增技術與實驗時(real-time)檢測技術結合起來，“分子信標實時擴增檢測技術”，能夠對檢測進行實時監(jiān)控，即稱為“EasyQ”14當前第14頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量檢測樣品采集運輸保存HIV-1，血漿樣品EDTA抗凝真空無菌采血管全血5ml或3ml*2,采集的樣品量應盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充分混勻，避免劇烈振蕩導致溶血15當前第15頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量檢測樣品采集運輸保存務必在采集全血的4小時內分離血漿，室溫下1500-3000r/min離心15分鐘送檢血漿2管，每管>1ml，冷凍(藏)運輸血漿樣本3天內送檢可在2-8℃暫時保存，1個月以內應凍存于-20℃以下，1年以內應置于-70℃以下血漿樣品凍融不應超過3次16當前第16頁\共有29頁\編于星期四\2點病毒載量檢測結果的解釋單位：copies/ml檢測限：20cps/ml(0.5ml)；10cps/ml(1ml);100cps/ml(0.1ml)結果舉例：

＜20copies/ml(檢測到HIV核酸，但是低于方法檢測下限，無法定量)TND(未檢出，使用現(xiàn)有的檢測方法對本次樣本未檢測到HIV核酸)17當前第17頁\共有29頁\編于星期四\2點樣品處理對病毒載量結果的影響一般地講，血漿中病毒載量水平比血清中的要高出30％～80％用EDTA抗凝劑的采血管采集全血后分離血漿樣本，其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相應含量多10％～15％及20％～25％18當前第18頁\共有29頁\編于星期四\2點樣品處理對病毒載量結果的影響采集全血后的3-6小時RNA丟失量最大，血漿樣本RNA丟失低于全血樣本。1小時以內，EDTA抗凝管RNA丟失約10％，ACD抗凝管丟失約20％；6小時以內，肝素抗凝管RNA丟失約30％。19當前第19頁\共有29頁\編于星期四\2點樣品處理對病毒載量結果的影響血漿樣本在-20℃冰柜保存3-14個月，與起始病毒載量水平值(0月)相比，3個月時變化沒有顯著性差異；6個月后下降值明顯，有隨著保存時間延長病毒載量水平下降幅度越大的趨勢。在-20℃冰柜內保存6個月，樣本病毒載量水平已不能真實反映樣本采集之初的水平，對疾病進展和療效評價，尤其對回顧性研究已無指導意義。20當前第20頁\共有29頁\編于星期四\2點樣品處理對病毒載量結果的影響-20℃條件下凍融3次比凍融1次HIVRNA降低約20％。許多研究者用多種檢測方法和不同人群樣本的研究結果證實，技術和生物因素對樣本RNA水平的影響是持續(xù)的和可預測的，大約在0.3-0.6log/ml之間。21當前第21頁\共有29頁\編于星期四\2點CD4+T淋巴細胞測定進行性且選擇性地消耗CD4細胞是HIV感染的特征。CD4細胞減少與機會感染增高相結合并且在個體感染HIV后病情呈進行性。CD4細胞殘余數(shù)在臨床預后治療監(jiān)測和新型抗逆轉錄病毒以及疫苗的臨床試驗入選標準工作中是最經常利用的實驗室測量項目22當前第22頁\共有29頁\編于星期四\2點CD4+T淋巴細胞測定準確及時地對殘留CD4細胞計數(shù)，不僅是評價性試驗，也是對存活的HIV感染者實施治療與關懷的一部分CD4細胞減少與機會感染增加和病情發(fā)展相聯(lián)系

CD4細胞計數(shù)為HIV感染臨床分期、疾病進展監(jiān)測、機會性感染的風險評估、抗病毒治療適應癥選擇及療效評價的實驗室指標23當前第23頁\共有29頁\編于星期四\2點流式細胞術(FCM)FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術。FALSSensorLaser24當前第24頁\共有29頁\編于星期四\2點流式細胞術特點單細胞的流動的活細胞的定量的多參數(shù)的高統(tǒng)計學精度的分選細胞25當前第25頁\共有29頁\編于星期四\2點CD4+T淋巴細胞測定的方法CD4+和CD8+T淋巴細胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應用流式細胞儀測定法，另一類是非流式細胞儀測定法常用的淋巴細胞計數(shù)檢測方法為自動檢測方法，包括流式細胞儀（主要有多平臺法和單平臺法）和專門的細胞計數(shù)儀26當前第26頁\共有29頁\編于星期四\2點雙平臺法雙平臺方法是一種細胞群體的絕對計數(shù)方法，利用血球計數(shù)儀檢測淋巴細胞數(shù)量，再根據流式細胞儀得到的細胞群體百分比，計算得到每微升的淋巴細胞數(shù)量。雙平臺法需要兩種儀器，由于儀器有系統(tǒng)誤差，計算結果的重復性和準確性影響因素較多，導致不同實驗室計數(shù)結果差異很大。最大的缺點在于操作步驟復雜，操作人員多、費時，因此很難將變異水平減小到最低。27當前第27頁\共有29頁\編于星期四\2點單平臺法應用三色、四色流式試劑配以內參絕對計數(shù)微球，加上流式細胞儀淋巴細胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細胞亞群的相對數(shù)(百分比)和絕對數(shù)。單平臺法最大程度地減少了多個儀器檢測帶來的檢測誤差，細胞絕對計數(shù)結果的重復性和準確性都得到了良好的保證。28當前第28頁\共有2