淺論Livin基因在非小細胞肺癌中表達的分子生物學特性

淺論Livin基因在非小細胞肺癌中表達的分子生物學特性

【關鍵詞】Livin基因;非小細胞肺癌;分子生物學

原癌基因和抑癌基因所編碼的蛋白存在于細胞的各個組成部分中，包括細胞核、細胞質(zhì)、線粒體和細胞膜。通過對原癌和抑癌基因蛋白結(jié)構(gòu)和功能的分析，發(fā)現(xiàn)許多原癌基因和抑癌基因位于信號通路中的不同部位，參與許多重要的細胞活動過程，如細胞生長和分化、DNA復制和損傷修復、基因轉(zhuǎn)錄和表達、細胞周期調(diào)控等，在細胞凋亡、衰老過程中起重要作用，也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族的新成員之一，具有抗細胞凋亡作用，并明顯地在腫瘤組織中特異性表達。目前的研究表明，Livin基因在各系統(tǒng)的正常組織中很少表達，但在胚胎組織或發(fā)育組織、淋巴細胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種組織中廣泛表達。非小細胞肺癌的腫瘤細胞系中也有Livin基因的表達，但其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥性等之間的確切關系尚不清楚。Livin基因特異性地表達于腫瘤組織，有可能成為NSCLC早期診斷的分子標志物，并為基因治療提供新靶點［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表達及其抗細胞凋亡作用、信號傳導途徑與調(diào)節(jié)機制等分子生物學特性作一綜述。

1Livin基因及蛋白結(jié)構(gòu)功能的多樣性

IAP是一類重要的抗細胞凋亡因子，其共同的結(jié)構(gòu)特征是N端含有一個或多個(最多為3個)串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復序列結(jié)構(gòu)域(baculovirusIAPrepeatsdomain，BIRs)和C端含有一個環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RINGfingerdomain，RING)。目前已發(fā)現(xiàn)人類IAP家族有8個成員，即NIAP,XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP)和livin(MLIAP/KIAP)［2］。

Livin蛋白是IAP家族的一個新成員，一些實驗室采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法，分別從人類基因組cDNA文庫中克隆得到Livin核苷酸序列，從不同的組織中發(fā)現(xiàn)了Livin基因的表達。Kasof等［3］在發(fā)育組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)并命名了Livin基因。Lin等［4］從人胎腎cDNA文庫中分離到該基因，故稱其為KIAP。Vucic等［5］發(fā)現(xiàn)Livin基因在G361和SKMel29兩種黑色素瘤細胞源株中高表達，將其命名為MLIAP。Ashhab等［6］發(fā)現(xiàn)了該基因存在2個剪接變異體，分別命名為Livinα和Livinβ。同時，Lin等［4］用熒光原位雜交方法確定Livin基因位于人20號染色體區(qū)域，全長kb，包含7個外顯子。此外還發(fā)現(xiàn)存在長約,和kb的轉(zhuǎn)錄子，Livin蛋白N端僅包含一個BIR結(jié)構(gòu)，包含4個α螺旋和一個三股抗平行β片層，與相應的氨基酸殘基共同構(gòu)成疏水核心。C端含有一個RING環(huán)指結(jié)構(gòu)［4,6］，氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結(jié)合，借以穩(wěn)定整個重疊結(jié)構(gòu)。

Livin蛋白有α和β兩種變異體，分別由298和280個氨基酸組成，二者相差18個氨基酸，此區(qū)域由介于BIR和RING結(jié)構(gòu)之間的第6外顯子5′端54bp的基因序列編碼。Livin蛋白主要表達于胞質(zhì)，但Kasof等［3］認為livin蛋白的細胞內(nèi)分布與Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞質(zhì)內(nèi)呈絲狀表達，同時也表達于胞核，并認為livin蛋白C末端的RING結(jié)構(gòu)對介導其在亞細胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA3′端非翻譯區(qū)多腺苷酸化與存在未剪接加工成熟的前體RNA有關，不同的剪輯有不同的變異體及亞型，這種結(jié)構(gòu)基礎有可能解釋Livin基因蛋白存在多個結(jié)構(gòu)功能。如BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個氨基酸的突變就能發(fā)揮其抗凋亡作用，作者的實驗也發(fā)現(xiàn)在A549細胞中表達的Livin蛋白缺少66個核苷酸的變異體，其確切的功能意義尚不清楚。但Livin基因蛋白結(jié)構(gòu)的變化與其功能的多樣性存在明顯的相關性。

2Livin基因在NSCLC中的表達

Livin基因僅在少數(shù)正常組織中表達，各家報道的研究結(jié)果存在較大差異，目前還不能確定Livin基因在人正常組織中的表達譜及其生理意義［2,7］。Tanabe等［7］采用RTPCR法對15例正常肺組織和38例NSCLC組織作對比研究，發(fā)現(xiàn)LivinmRNA在NSCLC組織陽性率為%，正常肺組織陽性率為%，顯示Livin基因在NSCLC中呈高表達，同時證明Livin基因與Survivin基因在NSCLC中的表達并不相關。CrnkovicMertens等［1,8］同時采用NSCLC組織和NSCLC源HeLa細胞株培養(yǎng)檢測Livin基因及其兩種異構(gòu)體Livinα和Livinβ的表達，結(jié)果顯示Livinα和Livinβ在NSCLC中呈高表達。采用RNAi技術(shù)分別使異構(gòu)體基因沉默，發(fā)現(xiàn)Livinβ和Livinα基因的功能意義不完全相同，Livinβ在細胞凋亡中起關鍵作用。國內(nèi)崔肅等［9］采用RTPCR法檢測NSCLC組織中LivinαmRNA和LivinβmRNA的表達，并用Westernblot方法分析Livin蛋白的表達，結(jié)果顯示45例NSCLC組織中LivinmRNA表達陽性率為％，兩種異構(gòu)體基本同時表達，LivinβmRNA的表達量略高于LivinαmRNA。而在癌旁正常肺組織和肺良性瘤樣病變組織呈低表達，陽性率分別為％和％。而且LivinmRNA表達陽性標本中均能檢測到Livin蛋白表達。陳淼等［10］采用免疫組織化學(SABC)的方法檢測Livin蛋白在40例NSCLC組織以及12例正常和肺良性疾病組織中的表達，結(jié)果顯示22例腺癌和18例鱗癌組織中的Livin蛋白陽性率分別為﹪和﹪，而正常肺組織和肺良性疾病組織均未檢出Livin蛋白表達。他們同時觀察到不同分化程度NSCLC組織之間Livin蛋白的表達無顯著性差異。有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中Livin蛋白表達的陽性率分別為﹪和﹪,兩組的顯著性差異標志著不同的生物學特性。孫建國等［11］的研究結(jié)果顯示，48例NSCLC組織中LivinmRNA表達陽性率為%，其表達與NSCLC組織學類型相關，腺癌中LivinmRNA表達陽性率達%，明顯高于鱗癌和大細胞癌，而癌旁組織和肺良性疾病組織均未檢出陽性結(jié)果，而且Livin蛋白表達與mRNA表達相一致。研究還發(fā)現(xiàn)放、化療后NSCLC組織中的Livin表達的陽性率為%，顯著高于未放、化療組織，提示放、化療可明顯誘導Livin蛋白的表達，這可能與臨床上NSCLC對化療藥物和放療耐受有關。

目前，Livin基因在NSCLC組織中特異性地高表達的現(xiàn)象已引起許多學者的關注［1２］，但LivinmRNA的表達與NSCLC患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等的相關關系尚未完全闡明，Livin基因作為NSCLC的分子標志物，成為診斷和治療NSCLC新靶點的可能性已引起人們的極大興趣。

3Livin抗細胞凋亡作用及其調(diào)節(jié)機制

Kasof等［3,8］研究顯示，Livin蛋白N端的羧基與Caspase3,7,9的直接結(jié)合，阻斷了caspase發(fā)揮凋亡作用的途徑，從而抑制了細胞凋亡的發(fā)生。將Livin基因轉(zhuǎn)染HeLa細胞，受轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)由FADD,Bax,RIP,RIP3及DR6誘導的細胞凋亡可被有效阻斷。Vucic等［13］將Livin基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細胞，證實轉(zhuǎn)染細胞對Fas,TNFR1,DR4及DR5介導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用。許多化療藥物可導致腫瘤細胞DNA的損傷而誘導細胞凋亡，轉(zhuǎn)染Livin基因的MCF7細胞可有效對抗阿霉素以及4TBP誘導的細胞凋亡。但是各家報道Livinα和Livinβ蛋白的抗細胞凋亡作用存在一定差異。Yang等［14,15］觀察在JurkatT淋巴細胞株中，Livin基因可明顯抑制由TNFα及抗CD95抗體誘導的細胞凋亡，其抗細胞凋亡作用強于Bcl2。Livinα對STS誘導的Jurkat細胞凋亡表現(xiàn)出一定的抑制作用，而Livinβ則無此作用。CrnkovicMertens等［8］采用RNA干擾技術(shù)分別使內(nèi)源性Livinα和Livinβ基因沉默，檢測兩者的抗凋亡作用，結(jié)果顯示Livinβ可顯著抑制依托泊苷和紫外線放射治療等誘導的HeLa細胞凋亡，但Livinα則不明顯。更多的研究則認為Livinα和Livinβ基因均具有抗細胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途徑有待進一步證實。

許多研究證實［12-16］，Livin蛋白介導細胞凋亡抑制存在不同的調(diào)節(jié)途徑，通過與激活形式的Caspase3和Caspase7結(jié)合，抑制其活性。Livin蛋白還可與未加工的或斷裂形式的Caspase9結(jié)合，可抑制由Apaf1、細胞色素C及dATP誘導的Caspase9激活作用。Livin蛋白與Caspase的結(jié)合抑制作用具有高度的特異性和親和性，BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個氨基酸的突變即可導致Livin蛋白與Caspase的結(jié)合作用的減弱或消失，致使Livin蛋白抗細胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失，這也許可成為基因治療的調(diào)節(jié)點。Sanna等［12］的研究顯示，Livin可激活MAP激酶JNK1和JNK2，但對JNK3無激活作用，而Livin蛋白對JNK1的激活作用遠遠強于JNK2，并且這是Livin蛋白對抗TNFα和ICE介導的細胞凋亡作用的重要途徑之一。JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白對JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號途徑，而是通過TAB1/TAK1途徑實現(xiàn)。TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。TAB1是TAK1的共活化因子，TAB1本身對于JNK1無激活作用，但可促進TAK1介導的JNK1激活作用。Livin蛋白可與TAB1結(jié)合，并進一步激活TAK1。此外，Vucic等［13］證實SMAC及活性肽片段可與Livin蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，抑制Livin蛋白與caspase的結(jié)合及其抗細胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導的對Livin蛋白抗細胞凋亡作用的負性調(diào)節(jié)機制。

4Livin基因治療NSCLC的臨床應用前景

鑒于Livin基因具有明顯的抗細胞凋亡作用以及在腫瘤組織中的特異性表達，人們注意到其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，并開始探討Livin用于腫瘤基因治療的可行性。應用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可獲得穩(wěn)定表達Livinα和Livinβ的NSCLCA549細胞克隆。孫建國等［17］用平板克隆形成實驗研究A549細胞生長情況，用MTT法檢測其對放、化療的敏感性，用細胞周期分析法觀察細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Livinα和Livinβ基因后的細胞尤其是表達Livinα的A549細胞，克隆形成能力提高、倍增時間縮短，對多種化療藥物和放射線敏感性降低，10Gy放射線照射下僅有%細胞發(fā)生凋亡?？梢奓ivin基因參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，也可能是NSCLC細胞對放、化療耐受的重要機制之一。

CrnkovicMertens等［18］利用基因轉(zhuǎn)染和特異性小干擾RNA(siRNA)技術(shù)，在肺癌SPCA1細胞株中建立Livin異構(gòu)體α和β特異的基因沉默體系，觀察誘導SPCA1細胞凋亡效應中的不同作用，并用TUNEL法和流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示內(nèi)源性Livinα和Livinβ基因沉默后，SPCA1細胞克隆形成能力較對照組顯著下降，促使SPCA1細胞發(fā)生凋亡，表明Livinα和Livinβ兩種異構(gòu)體均能作為誘導肺癌細胞凋亡的分子靶點，通過使Livin基因沉默的靶向誘導肺癌細胞凋亡可作為手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段。

由于Livin基因僅在腫瘤組織表達而在正常組織極少表達，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和腫瘤組織中均檢測到自身Livin蛋白抗體，其組織特異性顯而易見。Hariu等［20］用Livin反義核苷酸片段刺激周圍淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)HLAA24與Livin7肽具有特殊親和力，Livin蛋白表達陽性的NSCLC患者可檢測到特異性細胞毒T淋巴細胞，而Livin蛋白表達陰性NSCLC患者則測不到CTLs。結(jié)果提示Livin蛋白可成為NSCLC免疫治療的靶點，將Livin7肽作為免疫制劑具有良好的應用前景。

綜上所述，Livin基因是腫瘤細胞凋亡途徑中的一個信號調(diào)節(jié)點，其在NSCLC組織中的特異性表達為NSCLC的診斷提供了新的分子標記物，亦可成為NSCLC治療的新靶點［21，22］。目前，人們已能在基因水平上干預因基因表達異常而導致的疾病，尤其是以mRNA為靶標的反義藥物，可抑制和消除致病基因的表達，達到治療的目點。因此，采用反義核苷酸、小分子抑制劑和免疫介入等基因治療手段直接阻斷Livin蛋白與目的分子的結(jié)合，可以促使腫瘤細胞的凋亡，為NSCLC的治療開辟新的途徑［23，24］。同時，對NSCLC患者腫瘤組織和外周血免疫細胞的Livin蛋白及其mRNA表達的聯(lián)合檢測，有可能成為NSCLC早期診斷、轉(zhuǎn)移風險和預后的分子標記物。

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