酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法演示文稿

酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法演示文稿當(dāng)前第1頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法ppt當(dāng)前第2頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的原理2熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作方法當(dāng)前第3頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)原理基礎(chǔ)知識(shí)

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van

Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)

。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。當(dāng)前第4頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)甲胎蛋白（αfetoprotein，AFP）

一種含4%碳水化合物的單鏈糖蛋白，分子量70KD，半衰期5天，由592個(gè)氨基酸殘基的單肽鏈組成?；蛭挥诘?對(duì)染色體4q1124q21區(qū)域，由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，屬于血清中一種α球蛋白，是一種胚胎性相關(guān)蛋白。自1963年發(fā)現(xiàn)以來，作為一種腫瘤特異性抗原已廣泛應(yīng)用于臨床。它對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義，同時(shí)對(duì)肝細(xì)胞癌的鑒別診斷，流行病學(xué)調(diào)查和理論研究都很有價(jià)值。當(dāng)前第5頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)原理一

ELISA的基礎(chǔ)是抗原（或抗體）的固相化及抗原（或抗體）的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原（或抗體）仍保持其免疫學(xué)活性。原理二

抗原(或抗體)可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性。原理三

固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA的三條基本原理當(dāng)前第6頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)雙抗體夾心法方法

用已知抗體包被，加入待測(cè)抗原，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色。

固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色應(yīng)用這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘c包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。當(dāng)前第7頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)雙抗體夾心法圖示1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生較深藍(lán)色2、加腫瘤患者血清與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物無顏色或藍(lán)色很淡洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加健康人血清與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無（少）抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY當(dāng)前第8頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)儀器&試劑儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)儀、全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)當(dāng)前第9頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)試劑

待測(cè)血清、抗-AFP-L3抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……OR:甲胎蛋白（AFP）定量測(cè)定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）當(dāng)前第10頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)四、實(shí)驗(yàn)步驟獲得AFP未標(biāo)定抗體將AFP抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加血清形成固相抗體－抗原復(fù)合物當(dāng)前第11頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加HRP酶標(biāo)抗體生成抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的HRP酶標(biāo)抗體加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行AFP的定量測(cè)定當(dāng)前第12頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)詳細(xì)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。當(dāng)前第13頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)前第14頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)辣根過氧化物酶(HRP)常用底物：(1)鄰苯二胺(OPD)：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍(lán)色沉淀物反應(yīng)后呈藍(lán)色。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。當(dāng)前第15頁\共有17頁\編于星期四\13點(diǎn)五、結(jié)果分析以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，