植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物原生質(zhì)體培養(yǎng)第一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)原生質(zhì)體的用途

植物原生質(zhì)體(protoplast)是沒有細胞壁的裸露細胞，它在一些研究方面具有獨特的優(yōu)勢。第二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日1.原生質(zhì)體是研究細胞骨架、細胞壁的形成、細胞膜的結(jié)構(gòu)、大分子物質(zhì)進出細胞過程與機理等問題的良好實驗體系。2.轉(zhuǎn)基因的良好受體：與外源DNA（如質(zhì)粒）共培養(yǎng)時，原生質(zhì)體可以直接吸收外源DNA，并整合到染色體上，從而實現(xiàn)對植物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化，進一步通過植株再生就可得到轉(zhuǎn)基因植物。第三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日GFP質(zhì)粒濃度對煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)基因效率的影響GFP=綠色熒光蛋白第四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日PEG介導(dǎo)的甜橙原生質(zhì)體轉(zhuǎn)GFPPCR分析Sothern雜交分析第五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日3.體細胞雜交（somatichybridization）：由于原生質(zhì)體沒有細胞壁，所以不同的原生質(zhì)體可以相互靠近，發(fā)生融合。2種不同植物體細胞發(fā)生融合的過程，稱為體細胞雜交。所得到的融合細胞為雜種細胞，再通過植株再生就可能創(chuàng)造出新的植物個體。第六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日Tomato-potatohybrid第七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)原生質(zhì)體的分離

要進行原生質(zhì)體培養(yǎng)和操作，就必需有大量高質(zhì)量的原生質(zhì)體。分離原生質(zhì)體主要采用酶解法。酶解法：利用酶降解植物細胞壁而獲得原生質(zhì)體。酶解法分離原生質(zhì)體的效率高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生質(zhì)體，已成為分離原生質(zhì)體的最主要方法。第八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日第九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日一、

材料的選擇

用于分離原生質(zhì)體的植物材料應(yīng)是細胞分裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉等；處于快速生長期的愈傷組織或懸浮細胞。對于容易培養(yǎng)、再生能力強的葉植物（如煙草、菊花、胡蘿卜、矮牽牛等）也可用完全展開的葉片作材料。第十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日二、酶解處理

1.酶解液準備：由于植物細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成的，所以酶解液中一般應(yīng)含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，濃度為0.5-2.0%。在配酶解液時可以用原生質(zhì)體培養(yǎng)基作溶解劑，也可用專門的溶液（CPW溶液）作溶解劑。第十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日CPW=Cell-ProtoplastWashMedium

KH2PO427.2mg/LKNO3101.0mg/LCaCl2·2H2O148.0mg/LMgSO4·7H2O246.0mg/LKI0.16mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/L第十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

為了保持釋放出來的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性，必須使原生質(zhì)體處于一個等滲環(huán)境中。因此，酶解液中必須加入滲透壓調(diào)節(jié)劑。

常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度一般為0.35-0.8mol/L。具體用什么濃度，可根據(jù)材料的水勢來確定。酶解液配制好后，要用過濾滅菌的方法進行滅菌，并且隨配隨用。第十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日2.酶解：將植物材料放入酶解液中、釋放出原生質(zhì)體的過程。葉片、幼莖和根等材料要切成小片；葉片最好撕去下表皮。懸浮細胞要離心后再酶解。材料與酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液。一般在25±2℃、黑暗中酶解，期間輕輕搖動幾次，或放在50rpm的搖床上。酶解時間因材料而異，2小時~十幾小時。

第十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日苜蓿葉片的酶解法分離原生質(zhì)體第十五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日三、原生質(zhì)體的收集與純化過濾：酶解結(jié)束后，將酶解物通過孔徑為20-80μm的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去未被酶解的組織塊和細胞團。離心：濾液轉(zhuǎn)到離心管中在50×g下離心5min。反復(fù)洗滌：離心結(jié)束后，棄去上清液，用培養(yǎng)基和原生質(zhì)體洗液重新懸浮沉淀的原生質(zhì)體，再離心。如此反復(fù)2-4次，就可以將殘留的酶液去掉。純化：用含高濃度（21%）蔗糖的培養(yǎng)基進行離心、純化，完整的原生質(zhì)體漂浮在上清液的上部。第十六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日苜蓿葉片原生質(zhì)體的純化完整的原生質(zhì)體第十七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日5.收集原生質(zhì)體：第十八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日完整的原生質(zhì)體第十九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日四、原生質(zhì)體活力的測定

原生質(zhì)體活力的高低對后來的原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合影響極大。原生質(zhì)體分離過程中的任何一個步驟都會影響到原生質(zhì)體的活力，因此，必須十分小心。測定原生質(zhì)體活力的方法常用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法。原生質(zhì)體活力（%）=發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100第二十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日FDAFDA熒光素酶水解紫外光熒光素完整、有活力的原生質(zhì)體細胞核熒光素雙醋酸酯第二十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體制備好后，用培養(yǎng)基將原生質(zhì)體調(diào)至一定的密度（最低起始細胞密度以上），及時地進行培養(yǎng)。第二十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

在適宜的培養(yǎng)條件下，原生質(zhì)體數(shù)小時后開始形成新的細胞壁，在顯微鏡下可見原生質(zhì)體由圓球形逐漸變?yōu)榉叫?、多邊形等。約24-36h后，原生質(zhì)體開始發(fā)生第一次分裂；以后隨著細胞分裂，原生質(zhì)體就形成細胞團，進一步誘導(dǎo)出植株。第二十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日苜蓿原生質(zhì)體分裂第二十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日6weeks8weeks苜蓿原生質(zhì)體形成細胞團第二十五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日苜蓿原生質(zhì)體再生植株第二十六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)GFP基因的苜蓿原生質(zhì)體再生植株第二十七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日夜來香原生質(zhì)體植株再生1天5天7天10天第二十八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日4周5周7周第二十九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日單倍體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)與植株再生第三十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日楊樹原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生7000,000cells/gfreshleaves25000cells/ml;NH4NO3-freeMS+5M2,4-D+0.05TDZM.PE:34.7%atday14第三十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日楊樹原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生LiquidMS+5M2,4-D;MS+10MKTor1MTDZ.第三十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日楊樹原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生1/2MS第三十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

將含原生質(zhì)體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其成一薄層，封口后進行培養(yǎng)。1.

液體淺層培養(yǎng)原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法含原生質(zhì)體的液體培養(yǎng)基第三十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日特點：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷?。蝗菀滋砑有迈r培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物；原生質(zhì)體分布不均勻，易發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連；原生質(zhì)體的位置不能固定，所以不能跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的生長過程。第三十五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日2.固體培養(yǎng)（平板培養(yǎng)）35℃左右的瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基與原生質(zhì)體溶液混合，搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，瓊脂或瓊脂糖凝固后，就成一薄層。進行平板培養(yǎng)時，要注意混合時培養(yǎng)基的溫度。溫度高對原生質(zhì)體的傷害大；溫度低，培養(yǎng)基凝固，原生質(zhì)體與培養(yǎng)基不能混勻。特點：原生質(zhì)體被固定，易觀察、統(tǒng)計原生質(zhì)體的分裂情況；添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物比較麻煩。含原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)基第三十六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日（1）液體淺層—固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點是固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)可以緩慢釋放倒液體培養(yǎng)基中。如果在固體培養(yǎng)基中加入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)物分泌的有毒物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的生長和分裂。3.液體—固體結(jié)合培養(yǎng)固體培養(yǎng)基含原生質(zhì)體的液體培養(yǎng)基第三十七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

（2）瓊脂糖珠培養(yǎng)：用移液管吸取含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基，滴在培養(yǎng)皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入適量的液體培養(yǎng)基，進行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。也可以等含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基凝固后，用刀將其切成小塊，再放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。改進了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進可以促進原生質(zhì)體的分裂及細胞團的形成。含原生質(zhì)體的瓊脂糖珠液體培養(yǎng)基第三十八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

在培養(yǎng)過程中，原生質(zhì)體分裂開始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸降低，否則會影響細胞的繼續(xù)生長、分裂。待原生質(zhì)體形成的細胞團（愈傷組織）達到1mm時，應(yīng)將細胞團轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。所形成的愈傷組織就可以按照普通的愈傷組織進行培養(yǎng)和植株再生。

第三十九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日第四十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日三、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素

原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的好壞，也可以用植板率來衡量。1.植物材料：用于分離原生質(zhì)體的植物材料對原生質(zhì)體后來培養(yǎng)的效果影響極大。不同的植物、同一植物不同的品種，其遺傳組成存在差異，原生質(zhì)體的培養(yǎng)效果也就必然有差異。如Yamada曾用26個水稻品種的種子誘導(dǎo)出愈傷組織，再建立懸浮細胞培養(yǎng)，以懸浮細胞分離原生質(zhì)體，結(jié)果只有1個品種的原生質(zhì)體再生了植株。一般來說，容易培養(yǎng)的植物、外植體，其原生質(zhì)體也容易培養(yǎng)，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。

第四十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日2.

培養(yǎng)基（1）基本培養(yǎng)基：不同植物原生質(zhì)體要求有不同的基本培養(yǎng)基。使用什么基本培養(yǎng)基，可以參照相應(yīng)培養(yǎng)愈傷組織或細胞的培養(yǎng)基。一般認為，原生質(zhì)體培養(yǎng)基種的大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的大量元素濃度低。由于Ca2+影響到膜的穩(wěn)定性，因此較高Ca2+濃度的對原生質(zhì)體分裂有利。第四十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日（2）有機成分：同培養(yǎng)細胞、愈傷組織相比，培養(yǎng)原生質(zhì)體時要求培養(yǎng)基有更豐富的有機成分，如氨基酸、維生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺有利于原生質(zhì)體的分裂。（3）激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細胞分裂素和生長素。由于2,4-D促進細胞分裂能力很強，所以培養(yǎng)基中大都要加2,4-D。（4）條件化培養(yǎng)基：使用條件化培養(yǎng)基可以大大促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。

第四十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日（5）培養(yǎng)基中的滲透壓：原生質(zhì)體無細胞壁，所以培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑（甘露醇、山梨醇等），以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。但滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度較高往往會抑制細胞分裂和后來的細胞生長。因此，培養(yǎng)基中滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度不能太高，并且在后來的培養(yǎng)過程中要逐漸降低甘露醇或山梨醇的濃度，以利于細胞的持續(xù)分裂和生長。

第四十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)

體細胞雜交(somatichybridization)由于沒有細胞壁的限制，原生質(zhì)體可以彼此靠近，通過膜的融合而融為一體。如果兩個相同的原生質(zhì)體發(fā)生融合，則可以實現(xiàn)染色體加倍。Protoplastfusion第四十五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日期盼的馬鈴薯與番茄雜種植株

如果兩個不同植物的原生質(zhì)體融合，則就可以形成一個新的雜種細胞，此雜種細胞通過植株再生，則可以得到雜種植株。兩個不同植物體細胞發(fā)生融合的過程，稱為體細胞雜交。第四十六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

體細胞雜交克服了有性雜交時生殖隔離的限制，為創(chuàng)造種間雜種、屬間雜種，甚至科間雜種創(chuàng)造了條件。體細胞雜交包括4個過程：

原生質(zhì)體的分離；

原生質(zhì)體的融合；雜種細胞的選擇和植株再生；雜種植株的鑒定。

第四十七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日一、原生質(zhì)體的分離二、原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體融合的過程完全是一個機械過程，所有植物的原生質(zhì)體都可以發(fā)生融合。有些植物的原生質(zhì)體可以自發(fā)融合，但大多數(shù)植物的原生質(zhì)體需要在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下才能發(fā)生。誘導(dǎo)原生質(zhì)體的方法有化學(xué)法和物理法2種。第四十八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日（一）化學(xué)誘導(dǎo)法化學(xué)誘導(dǎo)法是利用一些化學(xué)物質(zhì)，如NaNO3、聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）、高鈣高pH等。原理：消除原生質(zhì)體表面的電荷，促進原生質(zhì)體彼此靠近、接觸，并能促進接觸處的細胞膜發(fā)生融解，從而實現(xiàn)原生質(zhì)體融合的。最常用的是聚乙二醇法和高鈣高pH法。

第四十九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日(1)

聚乙二醇法（PEG）聚乙二醇（PEG）是高分子的有機化合物。用于誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合PEG的分子量為6000。PEG誘導(dǎo)融合劑一般用0.01mol·L-1CaCl2·2H2O溶液配制，PEG濃度為30%-50%，蔗糖濃度為4%，可以用高溫高壓法滅菌，可以在4℃下保存。第五十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日(２)高鈣高pH法高鈣高pH法的誘導(dǎo)劑為：

0.05M甘氨酸-NaOH緩沖液

1.1%CaCl2·6H2O9%甘露醇

pH10.4（過濾消毒，隨用隨配）

第五十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日主要步驟：（1）在離心管中分別將2種植物的原生質(zhì)體密度調(diào)至5-8×105

個/ml，然后等體積混合。（2）向原生質(zhì)體混合液中加入等體積的誘導(dǎo)融合劑，輕輕搖勻后，放置10min。高鈣高pH法誘導(dǎo)融合時要保溫（30-37℃）。（3）離心（100×g，10min），棄去上清液，用培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體。（４）重復(fù)（３）２－４次，最后用培養(yǎng)基調(diào)至適當(dāng)?shù)拿芏取＃ǎ担┡囵B(yǎng)（液體淺層培養(yǎng)、平板培養(yǎng)等）第五十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日對稱體細胞雜交:2個原生質(zhì)體的細胞質(zhì)和細胞核完全融合形成一個雜種細胞。不對稱雜交：一個原生質(zhì)體的細胞質(zhì)完全丟失，另外一個原生質(zhì)體的細胞核完全丟失，再融合形成一個雜種細胞。

用X射線、γ射線、碘乙酸、碘乙酰胺處理一個原生質(zhì)體，使其核失活；用羅丹明（R-6-G，一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程）使另外一個原生質(zhì)體的細胞質(zhì)失活。第五十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B混合誘導(dǎo)劑混合，10min反復(fù)洗滌調(diào)節(jié)密度，培養(yǎng)，植株再生雜種植株選擇與鑒定射線、化學(xué)物質(zhì)處理射線、化學(xué)物質(zhì)處理第五十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

化學(xué)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合方法試劑便宜，成本低。但操作煩瑣，而且化學(xué)物質(zhì)的處理往往會影響原生質(zhì)體的活力，特別是不純凈的PEG。對原生質(zhì)體活力的影響與化學(xué)物質(zhì)濃度、時間有關(guān)。第五十五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日（二）物理方法（電融合，electrofusion）電融合誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合是在電融合儀上進行的。通過高頻（500KHz-2MHz）電場脈沖處理原生質(zhì)體，可以使接觸處的原生質(zhì)體發(fā)生膜穿孔，最終導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。這種方法操作比較簡單，無復(fù)雜的原生質(zhì)體洗滌過程，對原生質(zhì)體的副作用比較小。但電融合儀非常昂貴。

第五十六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日電融合儀下的薄荷原生質(zhì)體第五十七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日Exampleofprotoplastfusion-left:applicationofACfield,right:applicationofDCpulse第五十八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日

原生質(zhì)體融合是隨機過程。在大群體誘導(dǎo)融合時，A、B兩種原生質(zhì)體可以發(fā)生多種融合，如A-A，B-B，A-B。其中只有A-B是所希望的。挑選雜種細胞是比較困難的，主要方法有：

三、雜種細胞的鑒定第五十九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日1.

表觀差異：根據(jù)2種植物顯著的表觀差異，找出中間類型的細胞團。如正常綠色葉和白化葉的原生質(zhì)體融合后，其細胞的綠色程度就會介于2者之間。2.

選擇標記：抗性（抗生素、除草劑）標記、營養(yǎng)互補標記、顏色等。第六十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日PEG法誘導(dǎo)紅白菜與榨菜原生質(zhì)體融合與植株再生第六十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日融合過程第六十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日雜種體細胞,中間顏色(黃綠色與紅色)第六十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日雜種體細胞分裂、形成愈傷組織分化芽第六十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日四、再生植株的鑒定原生質(zhì)體融合后的雜種細胞以后生長情況：1、2個細胞的細胞質(zhì)和細胞核，保持完整、不丟失,同步分裂。對稱體細胞雜交（完全融合）2、一個細胞的細胞質(zhì)和核完全丟失，變?yōu)槠胀毎?、一個細胞質(zhì)完全丟失，另外一個細胞核完全丟失，質(zhì)-核雜種細胞。不對稱雜交4、一個或者兩個細胞的細胞質(zhì)和染色體不同程度丟失，質(zhì)-核雜種細胞（常常其中1個細胞的絕大部分染色體丟失，部分基因整合到另外一個細胞的基因組中）。不對稱雜交。第六十五頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日體細胞雜種再生植株的鑒定：1.形態(tài)觀測：2.

細胞學(xué)分析：3.分子鑒定：4.同功酶鑒定第六十六頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日再生植株的形態(tài)比較

紅白菜雜種植株榨菜第六十七頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日擬南芥與油菜原生質(zhì)體融合再生植株葉片形態(tài)擬南芥油菜雜種第六十八頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日薄荷原生質(zhì)體融合再生植株葉片比較第六十九頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日擬南芥蘿卜雜種擬南芥和蘿卜原生質(zhì)體融合再生植株比較形態(tài)比較第七十頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日擬南芥蘿卜DNA差異第七十一頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因trnL/TrnF線粒體基因orf138線粒體基因orfB蘿卜蘿卜蘿卜擬南芥DNA差異第七十二頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日玉米-小麥原生質(zhì)體融合再生植株玉米小麥原生質(zhì)體融合第七十三頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日玉米-小麥原生質(zhì)體融合再生植株第七十四頁，共八十六頁，編輯于2023年，星期日