醫(yī)學(xué)專題-第五章-海洋動(dòng)物的細(xì)胞操作

第五章海洋動(dòng)物(dòngwù)的細(xì)胞操作第一頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第一節(jié)概論(gàilùn)第二頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件一、定義(dìngyì)：

細(xì)胞操作（或細(xì)胞工程）:利用細(xì)胞融合和顯微操作等方法對(duì)生物體的基本單位-細(xì)胞(包括體細(xì)胞和生殖細(xì)胞)直接用手操作,創(chuàng)造出對(duì)人類有價(jià)值的物質(zhì)和生命體的技術(shù)。包括細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞器移植、染色體工程(gōngchéng)和組織培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞操作、染色體操作以及基因操作的關(guān)系密切，有時(shí)統(tǒng)稱細(xì)胞操作。第三頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第四頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第五頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第六頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件細(xì)胞融合（cellfusion）又稱細(xì)胞雜交（cellhybridization）。它是指用人工方法使2種或2種以上的體細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞，不經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程而得到雜種細(xì)胞的方法。在自然(zìrán)情況下，體內(nèi)或體外培養(yǎng)細(xì)胞間所發(fā)生的融合，稱為自然融合。而在體外用人工方法（使用融合誘導(dǎo)因子）促使相同或不同的細(xì)胞間發(fā)生融合，稱為人工誘導(dǎo)融合。第七頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第八頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件二、細(xì)胞工程的優(yōu)勢(shì)(yōushì)細(xì)胞工程的優(yōu)勢(shì)在于避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，只需將細(xì)胞遺傳物質(zhì)直接(zhíjiē)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中就能夠形成雜交細(xì)胞，因而能夠提高基因的轉(zhuǎn)移效率。第九頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件三、細(xì)胞操作(cāozuò)意義通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)，可以培育出新物種，打破了傳統(tǒng)的只有同種生物雜交(zájiāo)的限制，實(shí)現(xiàn)種間的雜交(zájiāo)。這項(xiàng)技術(shù)不僅可以把不同種類或者不同來(lái)源的植物細(xì)胞或者動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行融合，還可以把動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞融合在一起。這對(duì)創(chuàng)造新的動(dòng)、植物和微生物品種具有前所未有的重大意義。第十頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件四、細(xì)胞操作的基本(jīběn)手段包括增殖(zēngzhí)(通過(guò)培養(yǎng))分離(包括分割）混合(包括融合)移植(包括注入)第十一頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第十二頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件1、體細(xì)胞及配子的制備(1)細(xì)胞制備：除游離細(xì)胞(血球)外，在進(jìn)行體細(xì)胞分離時(shí)，要將組織切碎，用無(wú)Ca2+和無(wú)Mg2+的鹽溶液清洗，然后，再用胰蛋白酶或膠原酶消化，使細(xì)胞分離。(2)培養(yǎng)和維持：體細(xì)胞的保存精子的保存：特定的鹽溶液或冷凍法保存卵子的保存：采集(cǎijí)后立刻受精受精卵可在海水或淡水中發(fā)育第十三頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件2、卵和早期胚胎的細(xì)胞操作的前處理（1）卵膜的去除：不管是未受精卵還是受精卵，一接觸水即吸水，卵膜和卵的表面分離，很容易用鑷子剝?nèi)?，也可用蛋白酶消化除?chúqù)。所使用的酶有蛋白酶、木瓜酶、枯草溶菌素胰酶制劑等。不同的魚類，其卵膜消化的時(shí)間有長(zhǎng)有短。（2）無(wú)膜卵的培養(yǎng)：除去卵膜的卵(裸卵)抵抗物理沖擊能力很弱，所以應(yīng)盡可能不要移動(dòng)它。將裸卵放在有凍粉或角蛋白涂層的器皿里也能減少裸卵的損傷。第十四頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件（3）卵膜硬化的抑制：虹蹲卵受精后在1mmol/L還原型谷光甘肽水溶液(PH8.0)中吸水,可以阻止卵膜蛋白質(zhì)的—s—s—鍵形成(xíngchéng)的卵膜硬化。受精后已經(jīng)硬化的卵膜可用尖刀或手術(shù)刀切開(kāi)或用微型打孔器在膜上開(kāi)孔。第十五頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件五、海洋(hǎiyáng)動(dòng)物細(xì)胞操作特點(diǎn)1、海洋動(dòng)物自誕生以來(lái)，就生存在環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的海洋中，從無(wú)脊椎動(dòng)物到低等脊椎動(dòng)物(魚類)種類繁多。2、海洋動(dòng)物與陸生動(dòng)物相比，其體制比較原始(yuánshǐ)。多數(shù)配子(卵子和精于)排到體外(水中)受精，再發(fā)育成為個(gè)體。3、海洋生物具有多樣性的特點(diǎn)，并且取材容易。第十六頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第十七頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件六、研究(yánjiū)方向1、性別控制:性別控制是通過(guò)人為地干預(yù)并按人們的愿望使雌性動(dòng)物繁殖出所需性別后代的一種繁殖技術(shù)?？梢酝ㄟ^(guò)人工授精或體外授精將分離的優(yōu)良精子注入(zhùrù)受體，精子的分離可通過(guò)物理、免疫、流動(dòng)細(xì)胞等分離方法進(jìn)行分離。授精后，可通過(guò)胚胎性別鑒定，如染色質(zhì)、染色體組型鑒定法、雄性特異抗原鑒定或分子生物學(xué)SRY-PCR鑒定。第十八頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件2、嵌合體：嵌合體是由兩個(gè)遺傳上不同的細(xì)胞混合起來(lái)組成的生物體?？梢宰鳛橐环N研究用動(dòng)物、用來(lái)探索動(dòng)物的免疫寬容度、雜種優(yōu)勢(shì)和細(xì)胞譜系等，在理論研究上具有重要意義。在海洋動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的物種方面，能擴(kuò)大遺傳因子的范圍，培育(péiyù)山適應(yīng)環(huán)境變化的個(gè)體，即使在不能形成雜種的種類間，也可獲得具有雙親優(yōu)良品質(zhì)的物種。獲得嵌合體有多種方法，比較實(shí)用的方法是基因?qū)敕ǎ址Q基因工程。第十九頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件我國(guó)朱作言等(]985，1986，]989)利用顯微注射法將人生長(zhǎng)激素基因先后轉(zhuǎn)移到金魚、泥鍬、鯉魚和鯽魚中，培育出多種轉(zhuǎn)基因魚。英國(guó)人把老鼠生長(zhǎng)激素基因注入(zhùrù)虹蹲受精卵，培育出生長(zhǎng)快、個(gè)體大的超級(jí)虹蹲。第二十頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第二十一頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第二十二頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第二節(jié)性決定(性別(xìngbié)控制)一、海洋動(dòng)物性別決定的特點(diǎn)1、性染色體缺少或處于進(jìn)化的初始階段：海洋動(dòng)物一般缺乏性染色體或性染色體處于進(jìn)化的初級(jí)階段，不少種類(zhǒnglèi)性別受多基因影響，這些基因往往分布于不同的染色體上。2、表型性別容易改變，海洋動(dòng)物的性別容易改變，有些海洋動(dòng)物的性別在很大程度上受環(huán)境條件影響，有的其至完全取決于環(huán)境。如牡蠣,黑鯛第二十三頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件魚類的原始生殖上皮組織，同時(shí)具有決定向雌性發(fā)育的皮質(zhì)部分和決定向雄性發(fā)育的髓質(zhì)部分的兩個(gè)組織部分。在雌性激素作用(zuòyòng)下，皮質(zhì)部分會(huì)分化為卵巢，髓質(zhì)部分不發(fā)育而呈雌性具有產(chǎn)卵生殖功能；反之，在雄性激素作用(zuòyòng)下，魚會(huì)變成雄性的。所以，魚類性別分化具有相當(dāng)大的可塑性，完全可以按人們的要求，促進(jìn)魚類性別的轉(zhuǎn)化，獲得單性別的魚類。如羅非魚和虹鱒魚.

第二十四頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件（3）性變后個(gè)體具有正常的功能：徹底性反轉(zhuǎn)的海洋動(dòng)物都具有正常的生殖能力。性反轉(zhuǎn)個(gè)體在繁衍后代(hòudài)時(shí)，能依照性變后的表型性別產(chǎn)生配子,但性別遺傳型不變.第二十五頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件(4)YY型雄魚可育；YY型雄魚不但具有(jùyǒu)很高的成活率和正常的生育力，而且還可以被雌激素反轉(zhuǎn)為功能正常的雌魚。第二十六頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件二、海洋動(dòng)物性別控制的意義1、提高群體生長(zhǎng)率：雌雄性別個(gè)同．生產(chǎn)(shēngchǎn)性能往往不同。2、控制繁殖速度3、延長(zhǎng)有效生長(zhǎng)期4、提高水產(chǎn)品質(zhì)量第二十七頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件三、方法的選擇1、性決定的樣式，限于(xiànyú)雌同型--雄異型配子的動(dòng)物。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的性決定機(jī)構(gòu)不明顯。多數(shù)魚類，性染色體用x、Y表示，雌的XX型、雄的XY型。2、由于兩型精子在形態(tài)、組成、比重、生化特性、被膜抗原和活力等各方面的差異，有可能應(yīng)用各種方法，給以分離。X和Y精子的分離是性別控制的基本原理。第二十八頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件四、實(shí)驗(yàn)舉例：1、偽雄(XX型)及超雄魚(YY型)的培育：（1）排卵：給成熟雌性的金魚或鮒魚腹腔注射胎盤絨毛(róngmáo)膜促性腺激素100IU/mL，使其排卵。（2）將金魚的精液或泥鰍的精巢磨碎用林格氏液將原液稀釋100倍，作為稀釋精液用。第二十九頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件(3)偽雄(XX型)個(gè)體的培育：A、紫外線照射泥鰍稀釋精液；B、遺傳上不活化(huóhuà)的精子與金魚卵受精，誘發(fā)雌核發(fā)育；C、在22℃下接觸水5分鐘后，低溫處理卵(0℃,30min)，使其二倍體化；D、在孵化后20~80天期間、投喂添加50ug/g甲基睪酮飼料；所獲得的雄性個(gè)體,只產(chǎn)生X精子。第三十頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第三十一頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件(4)超雄個(gè)體的培育：A、給金魚卵γ射線照射(zhàoshè)，使其細(xì)胞核在遺傳上失去作用；B、然后立即用精子受精，誘導(dǎo)雄核發(fā)生；C、22℃，接觸水45min，后將卵用高溫處理(40℃，1min)，使其二倍體化。所獲得的雄性，全部是超雄個(gè)體(YY型)，只產(chǎn)生Y精于。第三十二頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第三十三頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第三節(jié)嵌合體動(dòng)物(dòngwù)的培育

一、意義：1、定義：所謂嵌合體（Chimera），是將兩個(gè)遺傳上不向的細(xì)胞混合(hùnhé)起來(lái)發(fā)育得到的生物體。2、完全的轉(zhuǎn)基因魚與嵌合體轉(zhuǎn)基因魚區(qū)別：

外源基因在受精卵分裂后某階段才整合入受體基因組中，則肯定那些從整合了外源基因的細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的組織才含有外源基因序列。這種僅在部分組織中整合有外源基因的動(dòng)物稱為嵌合體。第三十四頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件3、應(yīng)用：A、在海洋動(dòng)物水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，嵌合體主要以擴(kuò)遺傳因子的范圍，培合適應(yīng)環(huán)境變化的個(gè)體為目標(biāo)；B、即使在不能形成雜種的動(dòng)物之間，利用制作嵌合體的方法也可獲得具有(jùyǒu)雙親優(yōu)良品質(zhì)的動(dòng)物；C、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)用化，有必要用相同的外來(lái)基因置換特定的基因第三十五頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件二、方法的選擇：（一）嵌合體類型：1、胚細(xì)胞未分化的早期胚胎形成嵌合體：嵌合體的狀態(tài)將涉及(shèjí)整個(gè)細(xì)胞系(全身嵌合體，一次嵌合體)；2、器官形成后的胚成體形成嵌合體：局部嵌合體(二次嵌合體)，也可以形成特定的細(xì)胞系嵌合體：3、進(jìn)展：取自身的造血干細(xì)胞,在體外培養(yǎng)，導(dǎo)入有用基因后，再返回到體內(nèi)，以改變動(dòng)物遺傳特性的方法，已在哺乳類實(shí)用化第三十六頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件（二）操作方法：(1)凝集(níngjí)法(aggregationmethed)：除去卵膜后，在囊胚期用細(xì)玻璃針將胚盤的一部分刺傷、將其他胚盤的細(xì)胞塊移入第三十七頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件(2)顯微注射法(microinjectionmethed):將一個(gè)(yīɡè)胚盤分離出的分裂球,用毛細(xì)吸管注入另一胚盤的內(nèi)部(3)基因?qū)敕?genetransfermethed):在二細(xì)胞期后,用毛細(xì)吸管給一部分分裂球或單細(xì)胞的卵導(dǎo)入外源基因第三十八頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件第三十九頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件三實(shí)驗(yàn)(shíyàn)舉例1、人工催情，分別收集(shōují)魚的卵子和精液，體外人工受精；2、受精后3～5min，用0.25％的胰蛋白酶消化除卵殼；3、將裸卵移入盛有Holtfreter氏培養(yǎng)液的平面皿中；4、將外源基因裝入玻璃微針，在第一次卵裂前實(shí)施外源基因的顯微注射手術(shù)。每卵注射1—2nL的DNA溶液，約含1×106拷貝的外源基因；

第四十頁(yè)，共四十三頁(yè)。編輯課件5、顯微注射后，受體卵在Holffreter氏溶液中培養(yǎng)發(fā)育(fāyù)。6、胚胎發(fā)育至原腸期后，將培養(yǎng)液逐漸用暴氣的冷開(kāi)水稀釋；發(fā)育至心跳期后，將胚胎轉(zhuǎn)移到暴氣的冷開(kāi)水中直至形成魚苗。7、在胚胎發(fā)育過(guò)程中，需精心管理，及時(shí)去除死胚胎。

第四十一