第三章植物基因工程載體及其構建

第三章植物基因工程載體及其構建第一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)載體概述1.載體概念載體(vector)：能夠承載外源基因，并將其轉入受體細胞進行擴增和表達的DNA分子。運送外源基因高效轉入受體細胞；為外源基因提供復制能力和整合能力；為外源基因的擴增或表達提供必要的條件；功能所以，目的基因能否有效轉入受體細胞，并在其中維持高效表達，很大程度上取決于載體。第二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一具備復制原點，在宿主細胞內能夠自主復制；具備合適的酶切位點，供外源片段插入；含有供選擇轉化子的標記基因；適當?shù)目截悢?shù)：較高的拷貝數(shù)，便于回收、制備；載體的安全性：對受體細胞無毒害，不能隨便轉移；載體大小：原則上要求載體越小越好；如果需要外源基因的表達：啟動子。載體應具備的條件第三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2.載體的種類按來源分：細菌質粒載體病毒載體噬菌體載體轉座子載體Ti質粒Ri質粒人工染色體載體、線粒體載體、葉綠體載體等第五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一按功能分：克隆載體：主要用來克隆和擴增DNA片段，能帶動外源基因在宿主細胞中復制擴增。表達載體：除具有克隆載體的基本元件外，還具有轉錄、翻譯所必需的DNA元件，使外源基因在宿主細胞中有效表達。整合載體：將目的基因插入到受體染色體中。第六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一目的基因克隆載體中間載體卸甲載體轉化載體其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E.Coli小質粒為載體。切除致瘤基因的Ti質?；騌i質粒，是構建轉化載體的受體質粒。中間克隆載體中間表達載體大腸桿菌質粒插入T-DNA片段及目的基因、標記基因等。是構建中間表達載體的基礎質粒。含有植物特異啟動子的中間載體。作為構建轉化載體的質粒。最后用于目的基因導入植物細胞的載體，工程載體。由中間表達載體和卸甲載體構建。第七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)質粒載體質粒(plasmid)：存在于細菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀(線型質粒DNA分子——線蟲、衣藻等)雙鏈DNA分子(酵母的“殺傷質粒”是RNA)，可自身復制和表達。不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。分子量在1-200kb之間。1、質粒（plasmid）概念第八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一質?？臻g構型超螺旋：共價閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA：1條鏈上有一至數(shù)個缺口線型DNA：最快的是超螺旋，其次是線性DNA，最慢的是開環(huán)DNA。2、質粒（plasmid）構象第九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3、質粒的自主復制性①嚴緊型質粒（stringentplasmid）拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。②松弛型質粒（relaxedplasmid）拷貝數(shù)多，有幾十—幾百份拷貝。

質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制質粒。DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系根據在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停旱谑?，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4、質粒的不相容性同種的或親緣關系相近的兩種質粒，含有相似復制子結構，不能同時穩(wěn)定地保持在一個細胞內的現(xiàn)象，稱為質粒不相容性。不相容性的質粒組成不相容性群。在第二個質粒導入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時，不相容的質粒一般為利用同一復制系統(tǒng)，質粒分配到子細胞時會發(fā)生競爭，隨機挑選，最終放大。第十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一5、質粒的可轉移性接合型質粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用）。甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉移到受體菌種。非接合型質粒：不能再天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。某些非接合型質粒在接合型質粒的存在和協(xié)助，也能發(fā)生DNA轉移。由mob、tra基因順式因子bom及其內部的轉移缺口位點nic決定。第十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一6、攜帶特殊的遺傳標記物質抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成：抗生素、細菌毒素、有機堿對重組DNA分子的篩選十分重要！選擇標記：用于轉化子的挑選；篩選標記：用于重組子的挑選；轉化子：成功轉化了載體的宿主細胞；重組子：真正含有重組DNA的轉化子。按用途可分為選擇標記基因和篩選標記基因。第十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一篩選標記基因插入失活法第十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一互補篩選法lacZ編碼β-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可誘導其表達(乳糖既是誘導物,也是底物)；IPTG：乳糖衍生物，可作為lac操縱子的誘導物，但不能

作為反應底物；X-gal：可作lac操縱子的底物，不能作為誘導物。還可

作為生色劑，被β-半乳糖苷酶分解后產生蘭色物質，使

菌落呈現(xiàn)蘭色。第十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一lacZΔM15放在F質粒上，隨宿主傳代；lacZ’

放在載體上，作為篩選標記；受體菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。lacZ

ΔM15：缺失β-半乳糖苷酶第11-41個aa；lacZ’

：只編碼N端140個aa；lacZ

ΔM15+lacZ’

=功能互補在lacZ’

編碼區(qū)上游插入一小片段DNA(如51bp的MCS)，不影響β-半乳糖苷酶的功能互補。但在該小片段DNA中再插入一個片段，將導致產生無互補能力的β-半乳糖苷酶片段；第二十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第二十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一7、天然質粒載體的局限性（1）分子量大，拷貝數(shù)低第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。（2）篩選標志不理想，合適的單一酶切位點少ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。殺死不含ColE1質粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內部。第二十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一天然質粒相對分子質量拷貝數(shù)單一酶切位點選擇性標記復制類型pSC1015.8×1061~3EcoRItetr嚴緊ColE14.2×10620EcoRI大腸桿菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛改造策略：去掉多余片段：縮小質粒分子量，提高外源DNA片段的裝載量；減少限制性酶切位點：缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接酶...；提供多克隆位點易識別的選擇標記：通過質粒之間的重組導入；安全性改造：質粒載體不能在細菌間隨便轉移；增加輔助功能：表達載體。第二十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一8、常用的質粒載體（1）pBR322質粒載體F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構建載體。復制起點：pMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復制起點，高達1000-3000個拷貝；Ampr基因：pSP2124質粒的Ampr基因；Tetr基因：pSC101的Tetr基因；長度：4361bp；選擇標記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性；多克隆位點：24個克隆位點；其中9個會導致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。第二十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一衍生質粒：pBR325、pBR327及pAT153等。第二十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（2）pUC質粒載體UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎上改造而成。屬正選擇載體。復制起點：pBR322的oriAmpr基因：pBR322Ampr基因，不含原有酶切位點；lacZ啟動子：大腸桿菌；lacZ'基因：大腸桿菌lacZ的氨基酸片段；長度：約2.7kb；克隆位點：10個連續(xù)的單一酶切位點，位于lacZ'基因5’端。選擇標記：氨芐青霉素和藍白斑篩選；第二十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19更小的分子量；選擇方便：正向選擇，可顯色和抗菌素雙重直接選擇；克隆便利：具有多克隆位點，外源DNA方便插入；測序方便：pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉移到M13載體上測序。第二十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（3）pGEM系列載體由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側分別加了一個噬菌體啟動子T7和SP6?？蓪Σ迦肫芜M行轉錄。還加入了絲狀噬菌體f1的復制起點。第二十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（3）pBluescriptIIKS(±)系列載體在MCS的兩側分別加了一個噬菌體啟動子T7和T3?？蓪Σ迦肫芜M行轉錄。還加入了絲狀噬菌體f1的復制起點。第二十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一9、PCR產物克隆載體（1）T載體PCR產物往往在3’端突出一個或多個A，將T-載體的MCS中部已經切開，各有一個3’端突出的T。所以能與這個載體直接連接，這種克隆稱為T-A克隆。目前，目的基因的獲得幾乎都是用PCR的方法，如何將PCR產物連接到載體上？克隆載體線性化；克隆載體末端補平；克隆載體末端加T。第三十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一商業(yè)化T載體一般來說，商業(yè)化的T載體多是先使用平端限制性內切酶（如EcoRV）將克隆載體進行線性化，然后再單獨加入dTTP和Taq酶72～75℃反應，進行末端的加T。自制T載體一種常見的自制方法是利用限制性內切酶制造出具有單個T末端突出的片段，最常用的內切酶為XcmI，其識別和切割特點如下：第三十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第三十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第三十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一TOPO技術拓撲異構酶I在位點CCCTT切斷并松弛超螺旋DNA，然后重新連接末端。這樣，其同時作為限制酶和連接酶。TOPO克隆是一種將拓撲異構酶與T-載體相結合的PCR產物快速克隆系統(tǒng)pCR-TOPO，無需DNA連接酶做連接。3'末端的突出T上共價結合了一個拓撲異構酶Ⅰ，當帶3'末端的突出A的PCR產物與該T載體互補配對時，拓撲異構酶Ⅰ就將該缺口連接起來。第三十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一因為越來越多高確限度熱穩(wěn)定酶如Pfx、Pfu被用于PCR擴增，使到PCR后都只是平端產物。這種平端克隆往往效率低，并且有非特異性背景菌落產生，造成篩選困難。（2）平末端PCR產物載體第三十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一TOPO-Blunt載體在lacZ’基因的下游融合了一個ccdB（Controlofcelldeath）基因，該基因對大腸桿菌是致死的。載體切成線狀，再與目標DNA連接，轉化大腸桿菌。外源DNA片段與載體連接后，ccdB基因的表達受到阻斷，重組質粒才能在大腸桿菌中存在下來。如果沒有DNA片斷插入，ccdB基因則會表達，造成細菌染色體的降解導致細菌死亡。第三十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一TOPO克隆高效性原理Topo連接反應有兩個分子參與，而傳統(tǒng)的連接反應有三個分子參與，其熱力學上的優(yōu)勢導致5分鐘的快速連接。第三十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一10、質粒提取細菌培養(yǎng)和富集細胞懸浮細胞破碎細胞碎片基因組去除蛋白去除質粒收集溶液1：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，pH8.0溶液2：0.2NNaOH，1%SDS；溶液3：3M醋酸鉀，2M醋酸苯酚、氯仿抽提異丙醇/乙醇沉淀，70%乙醇清洗第三十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一具備復制原點，在宿主細胞內能夠自主復制；具備合適的酶切位點，供外源片段插入；含有供選擇轉化子的標記基因；適當?shù)目截悢?shù)：較高的拷貝數(shù)，便于回收、制備；載體的安全性：對受體細胞無毒害，不能隨便轉移；載體大?。涸瓌t上要求載體越小越好；如果需要外源基因的表達：啟動子。載體應具備的條件第三十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一11、大腸桿菌感受態(tài)制備及轉化（1）熱激法挑選單菌落過夜振蕩培養(yǎng)取1ml菌液+50ml培養(yǎng)基2-3h，OD600=0.6取1ml菌液+50ml培養(yǎng)基2-3h，OD600=0.6低溫低速離心收集細胞0.1MCaCl2懸浮處理細胞2ml0.1MCaCl2懸浮細胞，分裝，-80℃保存。感受態(tài)細胞制備轉化取出感受態(tài)冰浴解凍加入連接產物/質粒冰浴30min42℃熱激90S冰浴1min加入1mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)45min復蘇產物體系不超過1/10收集菌體，涂板篩選，過夜培養(yǎng)第四十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（2）電擊法當細菌長到對數(shù)中期；冷卻，離心；然后用冷卻的去離子水反復清洗；最后用10%甘油重懸；超低溫保存。感受態(tài)細胞制備轉化受電場強度、電脈沖長度和DNA濃度等參數(shù)的影響。電壓和電脈沖長度增高，轉化的細胞數(shù)量也有所提高，但存活率下降。電壓：2.5kv，電阻：300歐；電容：2.5uF第四十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一12、大腸桿菌重組子篩選和檢測第四十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一思考題

BamHⅠ

XbaⅠEcoRIBamHIXbaIPCR檢測正確，片段已經整合進載體；用BamHⅠ和XbaⅠ切不出目的片段；載體酶切位點在大腸桿菌中被甲基化；載體構建過程中出現(xiàn)星活性；第四十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)工程載體植物基因轉化載體必須具備的功能能作為媒介將外源基因導入到植物細胞中，并整合到宿主細胞的基因組DNA上；能提供被寄主細胞的復制和轉錄系統(tǒng)識別的DNA序列，即啟動子和復制子，以保證轉化的外源基因能在植物細胞中進行復制和表達。第四十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一一、根瘤農桿菌Ti質粒載體1、Ti質粒的遺傳特性及類型Ti質粒是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，約有200kb組成。章魚堿型(octopine)；胭脂堿型(nopaline)；農桿堿型(agropine)；農桿菌素堿型(agrocinoine)或稱琥珀堿型。根據其誘導的植物冠癭瘤中合成的冠癭堿種類的不同，Ti質?？煞殖伤姆N類型：第四十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一Agrobacteriumtumefaciens章魚堿型(octopine)第四十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2.Ti質粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，稱為轉移DNA。該DNA片段上的onc基因與腫瘤的形成有關。Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質粒DNA的三分之一。Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因（tra），調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。第四十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第四十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一T-DNA區(qū)(transferredDNAregions)T-DNA：農桿菌侵染植物時，從Ti質粒上導入植物細胞的一段DNA。23kb左右，攜帶有致瘤基因和冠癭堿合成酶基因；T-DNA區(qū)的致瘤基因是一些與激素合成有關的基因。這些基因的表達，破壞了植物體內正常的激素平衡，導致植物冠癭廇的出現(xiàn)；T-DNA兩端各有一高度同源的25bp的重復序列，分別稱為左邊界序列(LB)和右邊界序列(RB)，對T-DNA轉移到植物細胞至關重要(尤其是RB)。第四十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一Vir區(qū)的基因與T-DNA從細菌轉移到植物細胞的遺傳過程有關，能夠使農桿菌表現(xiàn)出毒性；Vir區(qū)總長約35kb，包括7個基因，VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH；VirA：組成性表達；

VirB、VirC、VirD、VirE：誘導性表達：

VirG：受信號分子誘導后表達量提高10多倍；信號分子：乙酰丁香酮等。Vir區(qū)(毒性區(qū))植物細胞創(chuàng)傷信號（AS）結合并激活VirA，VirA轉移磷酸基團激活VirG，形成二聚物，結合到Vir基因啟動子區(qū)域，激活這些基因的表達。雙因子調控體系。第五十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一毒性區(qū)對T-DNA的作用既可以順式作用進行，也可以反式作用進行。兩種情況下T-DNA都可在毒性區(qū)作用下轉移并整合到植物基因組中；順式作用：指T-DNA區(qū)與毒性區(qū)位于同一個Ti質粒上；反式作用：指T-DNA與毒性區(qū)不在同一Ti質粒上，而位于另一個相應的中間載體質粒上。第五十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一調控Ti質粒的自我復制。Con區(qū)(接合轉移編碼區(qū))具有在細菌間進行接合轉移的有關基因(tra)，調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。Ori區(qū)(originofreplication)細菌吸收和利用冠癭堿的區(qū)域，具有冠癭堿分解酶基因如章魚堿分解酶基因Occ。冠癭堿代謝區(qū)(opinecatabolism)第五十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第五十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4、Ti質?；蜣D化機理農桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。（1）T-DNA的加工及轉移下鏈25bp重復序列的右邊界左起第3和第4堿基間缺口剪切，然后從缺口5’端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22堿基處，置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。第五十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。

VirD1具有拓撲異構酶活性，將超螺旋DNA變?yōu)樗沙贒NA；VirD2具有核酸內切酶活性，切割雙鏈DNA的一條鏈。C端有核定位信號。VirC:包含VirC1和VirC2。

為ATPase，對質粒DNA的準確剪切是必需的。第五十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（2）T鏈復合物的形成T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜及核膜，才能整合進植物基因內。Ｔ鏈必須避免被核酸降解，因此Ｔ鏈可能以一種DNA-蛋白復合體形式存在。VirD2從T-DNA的產生到整合到植物基因組整個過程，都與T-DNA共價結合在一起。VirE2編碼ssDNA結合蛋白,與任何ssDNA結合。通達與Ｔ鏈非共價結合，VirE2可包被T鏈,形成細長的核-蛋白絲,因而故VirE2不僅保護ssDNA,使ssDNA抗3′和5′外切核酸酶和內切核酸酶，而且T使鏈形變成一種可轉運的形式。第五十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（3）T鏈復合物的轉運形成跨膜孔道，需要跨膜或者膜結合蛋白的參與；VirB蛋白在膜上形成一種類似于細菌結合轉移時從工體菌轉至受體菌所必需的結構，即接合孔或性毛，T-DNA通過這種孔由細菌進入到植物細胞。同時VirB也可能起運輸和提供能量的作用。第五十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（4）T鏈復合體靶向植物細胞核

VirD2及VirE2上有核定位信號，但VirE2與VirD2相比，其核定位功能較弱。VirD2可能以一種極性方向，首先將T復合體定向至核孔，而virE2則作為一種促進因子，保證很長的T復合體在進入核孔時不受干擾。VirD2及VirE2蛋白上的核定位信號與動物相似，說明植物和動物的這種信號從進化上講是保守的。第五十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一（5）T鏈整合到基因組T-DNA在植物染色體中的插入是隨機的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點常有以下特點：T-DNA優(yōu)先整合到轉錄活躍的植物基因位點；T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對；植物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。T-DNA的整合是異常重組的結果。T-DNA右未端在靶序列的識別及連接中是必需的，T-DNA左未端和兩個靶DNA未端則參與部分配對和DNA修復。第五十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一T-DNA插入的遺傳特性：T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導致靶位點處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。另一個常見的結果是，在T-DNA／植物DNA連接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（5～10b）同源，則可以在整合中起作用。第六十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第六十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4、Ti質粒的生物學功能為農桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；為寄主細胞合成植物激素IAA和細胞分裂素；誘發(fā)植物產生冠癭瘤并決定所誘導的腫瘤的形態(tài)學特征和冠癭堿成分；賦予寄主菌株分解代謝各種冠癭堿的能力；賦予寄主菌株對土壤桿菌素的反應性；決定寄主菌株的植物寄主范圍；抑制某些根瘤農桿菌噬菌體的生長和發(fā)育。第六十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4、Ti質粒的改造Ti質粒分子量過大，200kb左右，難以操作；分布著各種限制酶的多個切點，難以找到可利用的單一限制性內切酶位點；T-DNA區(qū)Onc基因的產物干擾宿主植物中內源激素的平衡，誘發(fā)腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；Ti質粒不能在大腸桿菌中復制,即使得到重組質粒，也只能在農桿菌中進行擴增；而農桿菌的轉化率極低（10％左右）拷貝數(shù)少；Ti質粒上還存在一些對于T-DNA轉移不起任何作用的序列。野生型Ti質粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：第六十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一一元載體和雙元載體第六十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第六十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第六十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一酶切連接系統(tǒng)第六十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一同源重組系統(tǒng)Gateway克隆技術是利用λ噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的λ嗜菌體位點特異重組系統(tǒng)的重組整合與切出反應。創(chuàng)建Gateway克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進入門載體?；旌习康幕虻娜腴T克隆和合適的目的載體及Gateway?LRClonase?酶，產生表達克隆。（表達克隆用來在合適的宿主中進行蛋白的表達和分析。）Gateway?技術也利用了ccdB選擇方法，以確保高效率的分離重組克隆。典型的效率是＞95％。第六十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一infusion重組系統(tǒng)第六十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一5、表達載體轉化根癌農桿菌感受態(tài)制備CaCl2法：與大腸桿菌基本一致區(qū)別：菌液需加入抗生素篩選；

培養(yǎng)時間更長；培養(yǎng)溫度28℃；

超低溫保存用甘油。轉化第七十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一轉化農桿菌后如何進行酶切鑒定？第七十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一二、發(fā)根農桿菌Ri質粒載體發(fā)根農桿菌與根癌農桿菌都能侵染植物細胞，但病癥不同。發(fā)根農桿菌侵染后植物細胞產生許多不定根。能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及裸子植物。發(fā)根農桿菌同樣具有與Ti質粒相似的稱之為Ri的巨大質粒。Ri質?？梢圆挥谩敖獬溲b”進行轉化，產生的發(fā)根能夠再生；發(fā)狀根是單細胞克隆，避免產生嵌合體；可直接作為中間載體；發(fā)根適于離體培養(yǎng)，離體培養(yǎng)次生代謝產物合成能力更強。根據轉化植物后產生的毛狀根合成冠癭堿的類型不同，分為：甘露堿型、黃瓜堿型和農桿堿型。第七十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一從發(fā)展植物基因工程載體考慮，Ri質粒是頗有吸引力的。這是因為在不同的雙子葉植物中，由Ri質粒誘發(fā)產生的合成冠癭堿不定根組織，經過培養(yǎng)基中的植物激素的刺激作用，都可再生成可育的完整的植株。解釋Ti質粒載體的許多概念對于Ri質粒載體也是適用的?，F(xiàn)在已發(fā)展出了Ri質粒載體的共合體系第七十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一三、植物病毒載體植物病毒及其它的一些病原體，是一類能夠在感染的植物寄主細胞中進行復制和表達的“外來的”核酸類型。以植物病毒作為植物基因工程的克隆載體具有的優(yōu)點。有一部分植物病毒對寄主的感染是系統(tǒng)性的，它能夠將其基因組擴散到被感染植株的所有細胞。植物病毒載體，如雙子座病毒組病毒由于具有廣泛的寄主范圍，存在著被發(fā)展作為單子葉植物基因克隆載體的潛力。被感染的植株能夠繁殖出大量的病毒顆粒。類型：單鏈的RNA植物病毒、單鏈的DNA植物病毒和雙鏈的DNA植物病毒。第七十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一1、單鏈的RNA植物病毒90％以上的植物病毒的遺傳物質，都是具有感染性的正鏈RNA。反轉錄酶和DNA聚合酶，將單鏈的病毒RNA轉變成雙鏈的DNA；然后把這種DNA克隆到一種原核生物的質?；蚩滤官|粒載體上；在形成的重組質粒分子中，外源基因是插入在dcDNA部分；將帶有外源基因的病毒載體重新導入植物寄主細胞。第七十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第七十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2、單鏈植物DNA病毒載體第七十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第七十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3、雙鏈DNA植物病毒載體花椰菜花葉病毒組和黃瓜脈病毒組將目的基因插入到CaMVDNA上特定的非功能區(qū)域，不影響病毒基因組的侵染性。CaMV侵染植物以后復制在寄主核內；目的基因不能整合到染色體上，但是可以穩(wěn)定表達；基因組35S啟動子可在植物細胞內高效表達，可用于基因過表達。局限性：容納外源基因能力有限，寄主范圍也有限；感染后寄主植物易患病，產量品質下降；不能感染整個植株，需通過原生質體克服。第七十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)標記基因選擇標記基因(selectablemarkergene)：編碼產物能使轉化的細胞、組織具有對抗生素、除草劑的抗性或代謝的優(yōu)越性，從而將轉化的細胞、組織篩選出來的一類基因；報告基因(reportergene)：編碼產物能夠被快速測定，用來判斷外源基因是否已成功導入受體細胞、組織，并檢測其表達活性的一類基因；報告基因實質上起到了標記基因的作用，故當其被用來區(qū)分轉化細胞時,也可將其稱為標記基因。第八十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一1

標記基因和報告基因的構建標記基因：與適當?shù)慕M成型啟動子構成嵌合基因，克隆在質粒載體上，導入受體細胞內；報告基因：將其編碼區(qū)

與位于其上游或下游的

目的基因融合，置于目

的基因啟動子的控制之

下,克隆到質粒載體上，

導入細胞內。第八十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2轉基因植物常用的標記基因編碼正常植物細胞中不存在的產物；基因較小，易構成嵌合基因；能在轉化體中得到充分表達；容易檢測，并能定量分析。選擇標記基因應具備的特征第八十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一常用的選擇標記基因抗生素抗性基因：npt(新霉素磷酸轉移酶),hpt(潮霉素磷酸轉移酶),cat(氯霉素乙酰轉移酶)等；除草劑抗性基因：pat(抗磷化麥黃酮),sul(抗磺胺類除草劑),epsps(抗草甘膦)；糖代謝途徑相關基因：pmi(6-磷酸甘露糖異構酶)激素代謝途徑相關基因：ipt(異戊烯基轉移酶),iaah(吲哚乙酰胺水解酶),dhfr(二氫葉酸還原酶)。第八十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3轉基因植物常用的報告基因已被克隆，全序列已測定；表達產物在受體細胞中不存在，也無相似的內源性表達產物，且對受體細胞無毒；表達產物能進行定量測定。報告基因應具備的特征β-葡萄糖酸苷酶基因(gus),螢光素酶基因(luc),綠色熒光蛋白基因(gfp)等。常用的報告基因第八十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一Gus基因的檢測Gus：來源于細菌，催化β–葡萄糖苷酯類物質的水解。絕大多數(shù)植物細胞不存在內源的GUS活性，因而被廣泛用作轉基因植