青蒿素分析方法的確定

青蒿素分析方法的確定第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二青蒿青篙為菊科一年生草本植物黃花篙干燥地上部分，性寒，味苦、辛，歸肝膽經(jīng)，可清熱解暑、除蒸、截瘧，主要分布于重慶、四川、云南、廣西等地。目前青篙素系列藥物已取代奎寧成為治療瘧疾的最安全有效的藥物。青蒿素是青蒿抗瘧的有效成分，也是合成青蒿素系列藥物的起始原料，它的需求量很大。第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二為什么要測定青蒿素的含量不同產(chǎn)地的青蒿藥材中青篙素的含量差異較大，而青蒿素是青篙截瘧的主要有效成分，因此對藥材中青篙素含量的準確測定十分必要。提取青蒿素的溶劑：青蒿素C15H22O5在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易溶,在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解,在水中幾乎不溶解;在冰醋酸中易溶。第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二青蒿素的有效成分

青蒿素是從黃花蒿中提取分離得到的含過氧基團的新型半萜內(nèi)酯。其多種衍生物均是治療瘧疾的有效單體，國內(nèi)外公認的首創(chuàng)新藥。將青蒿素結構中的C-10為羰基還原成羥基得雙氫青蒿素，進一步烷基氧化得蒿甲醚，而進行酯化可得到青蒿琥酯。青蒿素artemisinin第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二雙氫青蒿素為天然抗瘧藥青篙素經(jīng)鈉硼氫還原而產(chǎn)生的半縮醛化合物,其12位的羥基具有差向異構,差向異構體a與β在一定溶劑中有相互轉化并達到平衡的過程。DHA分子結構中無共扼結構和發(fā)色基團,不宜用分光光度法或HPLC法測定含量。雙氫青蒿素dihydroartemisinin雙氫青蒿素第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二定性分析定量分析紫外分光光度法IR、MS、NMRHPLC(UV、ELSD、SPD...)UPLCLC-MS/LC-MS-MS高效毛細管電泳CETLC第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.1青蒿素的IR定性分析雙氫青蒿素dihydroartemisinin第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二3376O-H;1227C-O;1025C-O-C;2925-CH3;總結：IR專屬性強，一般做標準譜圖對照法第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.2紫外分光光度法原理：1.由于青蒿素藥物分子結構中母核不具有共軛體系，其紫外吸收光譜的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同具有一定的吸收特征。2.青蒿素由于具有過氧橋和縮醛結構,對酸堿不穩(wěn)定,對強堿極不穩(wěn)定,熱至熔點以上即迅速分解。采用0.2%氫氧化鈉50℃水浴加熱30min進行水解,水解后的波長掃描結果顯示青蒿素在紫外區(qū)有最大吸收峰Kmax=290.5nm,由此確定最適波長為292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作HPLC-UV檢測）第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.青蒿素標準品0.1g+95%稀釋成0.001%的標準品溶液第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二2.0.001%標準溶液0.5ml加入95%乙醇4.5ml,再加入0.2%NaOH20ml定容至25ml,50℃水浴加熱30min,取出快速冷卻。第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二3.分別取0.5、1.0、2.0ml的.001%青蒿素標準溶液,分別加入95%乙醇4.5、4.0、3.0ml,再各加入0.2%NaOH20ml定容至25ml,配成濃度分別為2×10-5%、4×10-5%、8×10-5%的標準溶液,50℃水浴加熱30min,取出快速冷卻,在已經(jīng)確立的最適波長下分別測吸光度。第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二4.樣液的制備取青蒿待測樣品研細粉末0.5g,加入95%乙醇10ml浸泡,50℃水浴加熱60min進行提取,取出樣品振搖、冷卻、過濾,取濾液1ml,加入95%乙醇14ml,再加入0.2%NaOH10ml,配制成青蒿素樣品溶液,50℃水浴加熱30min。在已經(jīng)確立的最適波長下分別測吸光度,對濃度作圖,建立標準曲線。第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二∴青蒿素含量=(青蒿素樣品濃度×標準濃度單位×原始體積)/青蒿研細粉末質量朗伯比爾定律：A=-lgT=εbcb，ε一定，吸光度A和溶液濃度c成正比第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二UV法總結UV法測定青蒿素是依據(jù)青蒿素在堿性條件下生成的青蒿素衍生物Q292在292nm波長處有較強的紫外吸收來定量的，其優(yōu)點是操作簡單，對儀器設備的要求不高，其缺點是不能排除青蒿素類似物等物質的干擾。因此，UV法測定青蒿中青蒿素的含量實際反映的是藥材中青蒿素及其類似物的總量。陳靖等[5]報道，青蒿中青蒿素類似物青蒿酸、青蒿素B、3α-羥基-1-去氧青蒿素的平均含量分別為0.47％、0.05％、0.005％，對青蒿中青蒿素含量的測定影響較大，使得測定結果偏高。第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.3HPLC法常見檢測器:1.UV2.DAD（二極管陣列檢測器）3.FD（熒光檢測器）4.RID(示差折光率檢測器)5.ECD(電化學檢測器)6.ELSD（蒸發(fā)光散射器檢測器）原理：利用流動相與組分間的親和力，通過組分、流動相和固定相三者間的相互作用來實現(xiàn)分離。第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二文獻報道同時測定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高效液相色譜紫外電化學檢測法）、HPLC-MS/MS法,采用ELSD法（蒸發(fā)光散射檢測法）檢測僅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV法檢測青蒿中含量較低的青蒿乙素和青蒿酸。第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)為通用型的質量檢測器,對結構相似物質可給出幾乎相同的響應因子,響應值大小取決于物質濃度及檢測條件下物質顆粒的大小,而不依賴于紫外吸收,因此適合于青蒿素及雙氫青蒿素的含量測定。1.3.1HPLC-ELSD法第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二SPD(二極管陣列檢測器)與ELSD同時檢測,發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素轉化平衡后SPD圖中。a異構體與β異構體峰面積之比為4:1,而ELSD檢測得。a異構體與β異構體峰面積之比為8:1。因為ELSD對結構相似物質能給出幾乎一致的響應因子,屬于質量響應型檢測器,因此得到的峰面積比即為轉化平衡后a異構體與β異構體的實際物質量比。從而也可得知a與β異構體對UV的響應因子不同,如用UV檢測則不能直接采用二者峰面積之和定量。例：HPLC-ELSD法測定復方雙氫青篙素片中雙氫青篙素的含量第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二2.對照品溶液:取復方雙氫青篙素片10片,剝?nèi)ケ∧ひ?精密稱定,研細,精密稱取適量,置25mL量瓶中,加乙睛適量,40℃超聲處理5min。放冷至室溫,定容。搖勻,濾過,取續(xù)濾液2mL加水稀釋至10mL。例：復方雙氫青篙素片（含雙氫青篙素32mg,磷酸呱哇0.32g,甲氧芐啶90mg)中青蒿素含量的測定1.對照品溶液:精密稱取DHA對照品適量,置50mL量瓶中,加乙睛適量,40℃超聲處理5min。放冷至室溫,定容,即得1.28mg/mL的對照品儲備液。再精密量取此儲備液適量,用水稀釋制成256mg/mL的對照品溶液。第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二ELSD檢測器檢測時少量溶解的甲氧芐啶峰及a異構體峰與β異構體峰均能達到完全分離,三者的分離度分別為2、8和4,a異構體與β異構體保留時間分別約為5.7min和7min,理論板數(shù)按a異構體或β異構體峰計均不低于6000。SPD掃描圖譜顯示最先流出的成分為甲氧芐啶,與后面的a異構體及β異構體完全分離,不影響測定。第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.3.2HPLC-UV-ELSD同時測定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法進行精確定量分析,故選擇用ELSD法檢測。用ELSD法也可檢測青蒿乙素和青蒿酸,但由于其靈敏度低,對這兩個成分含量低的青蒿藥材來說,該法同時測定3種成分較困難,故采用靈敏度較高的UV法對青蒿乙素和青蒿酸進行定量測定。UV檢測器對所測成分性質無任何影響,據(jù)此可使用HPLC-UV-ELSD同時測定青蒿中3種成分。第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二色譜分析條件色譜柱:NucleodurC18(250mm×416mm,5μmD);流動相:乙腈-0.1%乙酸(50∶50);流速:110mL/min;柱溫:25℃青蒿乙素和青蒿酸用UV檢測器檢測,波長為209nm;青蒿素用ELSD檢測器檢測,漂移管溫度50℃,載氣(N2)壓力30psi(1psi≈619kPa),增益值為50;進樣體積為10或30μL。第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二HPLCchromatogramsofreference(A,B)andtheextractfromHerbaArtemisiaeAnnuae(C,D).A,C:UV；B,D:ELSD;1:ArteannuinB;2:Artemisinin;3:Artemisinicacid第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.2.2RP-HPLC1.常規(guī)的液相方法將青蒿素進行柱前衍生,將其與堿反應后,產(chǎn)生一化合物(Q292),該物質在292nm處有最大吸收,然而,由于反應后有無機堿存在,易損壞色譜柱,不適宜直接進樣測定。但化合物Q292在pH值5.58~6.04條件下,又可定量地轉化為化合物Q260,該物質在260nm處有最大吸收,可用于做HPLC測定[12]。2.又∵青蒿素在203nm處有弱吸收峰的性質，HPLC法在203nm直接測定,大多采用甲醇作溶劑稀釋對照品,使其在紫外區(qū)203nm處有極弱的吸收,其靈敏度及重復性均較差,(選用丙酮作溶劑,在203nm處有較強的吸收[11])。第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.衍生化法[13]：色譜條件：色譜柱:LichrospherC18(4.6mm×250mm,5Lm);流動相:甲醇-緩沖液(體積比50：50;0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液);流速:0.8mL/min;柱溫:30e;靈敏度:2.000AUFS;檢測波長:260nm;進樣量:20μL。第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二2.末端吸收[14]色譜條件：色譜柱KromasilODSC18(416mm×250mm,5μm);流動相為乙腈-水(60：40);流速為1.0mL/min;檢測波長為203nm;柱溫30℃。理論塔板數(shù)2000.第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.2.4LC-MS-MS體內(nèi)藥物分析是測定體液(主要是血漿、血清或全血)中藥物或其他代謝物濃度。由于血液樣品試樣提供量少，基質復雜，在此混合物中分析某種微量成分(通常為(g/mL或ng/mL水平)并加以鑒別，常常是對分析化學家的挑戰(zhàn)。藥物的是用來預防、診斷及治療疾病的一類特殊物質，與人們的健康和生命安危有極其密切的關系，雜質檢查及其限度控制是保證藥品質量的一個重要方面。使用LC-MS／MS可以簡便地對藥物中雜質加以監(jiān)控.LC-MS雖然有足夠的靈敏度，但遇到LC難以分離的組分，其應用受到限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干擾，通過MS／MS的選擇反應控制模式(SRM)或多反應檢測模式(SRM)，提高信噪比，因此對復雜樣品仍可達到很高的靈敏度。第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二分析條件色譜條件色譜柱為RESTEKPinnacleC18柱(150mm×2.1mm,5μm);流動相為甲醇-水-10mmol/L乙酸胺(80:10:10);流速200μl/min;柱溫:室溫。質譜條件電噴霧ESI源;噴霧電壓IS為4000V;霧化溫度400℃;霧化氣NEB(GAS1)為12L·min-1;加熱輔助氣AUX(GAS2)為7L/min;簾氣CUR為6L·min-1;碰撞氣CAD3L·min-1;檢測方式為正離子多離子反應監(jiān)測(MRM),用于定量分析的離子分別為m/z302.3→m/z163.3(DHA)和m/z300.2→m/z209.3(內(nèi)標ART)高液相色譜-質譜聯(lián)用法測定人血漿雙氫青蒿素濃度[24]第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二在選定的檢測條件下,DHA和內(nèi)標ART生成的基峰離子為其加NH4+離子[M+NH3]+,將其基峰離子作為母離子進行產(chǎn)物離子掃描分析,得到二者的全掃描及子離子掃描圖。第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二根據(jù)DHA離子掃描圖,在選定的檢測條件下,離子對mPz302.3→m/z267.1響應明顯高于m/z302.3→mPz163.3,但該離子對的測定易受到血漿內(nèi)源性物質的輕度干擾,為定量準確,選擇離子對m/z302.3→m/z163.3用于定量分析,不受基質效應的影響。第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二LC-MS/MS測定血漿雙氫青蒿素(DHA)的色譜圖A:空白血漿第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二B:空白血漿加DHA(3.03ng·ml-1)和內(nèi)標1:DHA雙氫青蒿素;2:內(nèi)標ART青蒿素第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二C:受試者藥后血漿樣品加內(nèi)標第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.3.5UPLC與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度都比HPLC要高。例：UPLC-UV測定青蒿素的含量[26]色譜條件：色譜柱:AgilentEclipsePlusC18(2.1mm×50mm，1.8μm);流動相:乙腈－水(45∶55);流速:1.0mL/min;柱溫:28℃;檢測波長:200nm;進樣體積:1μL。第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二1.4毛細管電泳毛細管電泳法(CE)具有高效、快速、樣品用量小、耗費少等優(yōu)點,已被廣泛用于藥物分析。CE電化學檢測具有裝置簡便易行、價廉、檢測靈敏度較高的優(yōu)點，它的性能在分離許多生化物質上要優(yōu)于一般的色譜法。帶電粒子與aq中電荷結合帶電水解帶電E定向運動電滲流第三十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二CE工作原理3-毛細管4-檢測器第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期二分離條件：分離介質4.0mmol/L三乙胺-2.0mmol/LH3BO3-15.0%C2H5OH,分離電壓22.0kV,20.0cm位差虹吸進樣15.0s。在該實驗條件下,可在5min內(nèi)實現(xiàn)對雙氫青蒿素的分離檢測,雙氫青蒿素的峰面積與含量在3.0～165μg/mL范圍線性關系良好,檢出限為1.0μg/mL。例：復方雙氫青蒿素片中雙氫青蒿素的測定[28]∵復方制劑中的其他成分在該條件下并不出峰,故不干擾測定,可能是在優(yōu)化條件下難以電離的緣故∴采用毛細管電泳非接觸高頻電導法對雙氫青蒿素進行了快速分析。第四十一頁，共四十五頁，編