新城疫抗體測(cè)定技術(shù)課件

國(guó)標(biāo)ND抗體測(cè)定技術(shù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院朱明恩

國(guó)標(biāo)：新城疫診斷技術(shù)（GB/T16525-2008）

2009-05-01實(shí)施本技術(shù)依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定是開設(shè)畜牧獸醫(yī)類專業(yè)學(xué)校學(xué)生的必會(huì)技能是新城疫抗體監(jiān)測(cè)和診斷的重要手段是2011和2012年全國(guó)農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項(xiàng)目，據(jù)說(shuō)還將是2014年全國(guó)農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項(xiàng)目安排本內(nèi)容的原因新城疫抗體測(cè)定基本操作規(guī)程制備被檢血清制備1%RBC懸液HA試驗(yàn)，測(cè)病毒的血凝價(jià)配制4單位病毒HI試驗(yàn)，測(cè)血清的抗體滴度抗體滴度報(bào)告，以nlog2形式報(bào)告儀器及材料

非免疫公雞、pH7.2生理鹽水、新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、新城標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、新城標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、3.8%的枸櫞酸鈉、96孔V型板、微量移液器、吸頭、微型振蕩器、溫箱、離心機(jī)、天平、采血器等。

心臟或靜脈采血2-3mL（不加抗凝劑），采血后使血液在采血器或滅菌干凈青霉素小瓶中凝固成斜面，室溫下2-3

小時(shí)或4℃冰箱中過(guò)夜使血清析出，也可通過(guò)離心加快血清析出。血清為淡黃色透明液體。一、制備被檢血清翅靜脈采血

針頭在靜脈血管一側(cè)傾斜刺入皮膚，再與血管平行進(jìn)針后刺入血管，見(jiàn)有少量回血即可采集血液，采血完成后馬上用手壓迫止血。心臟采血雞右側(cè)臥保定，上腿自然踡曲，在上腿膝關(guān)節(jié)稍前下方約1cm處（心臟搏動(dòng)最明顯的部位）垂直地面進(jìn)針采血。

二、制備1％RBC懸液

1.制備抗凝血

在采血器（注射器）中吸入抗凝劑（3.8%的枸櫞酸鈉，抗凝比例為1：10），心臟或靜脈采血3-4mL，顛倒采血器使血液與抗凝劑充分混勻，然后將血液注入離心管中，用天平配平。1．離心管、離心套管和管中液體作為一個(gè)整體進(jìn)行配平2．離心管中液體不能太滿配平注意事項(xiàng)

2.離心洗滌紅細(xì)胞（1）共洗滌3次，轉(zhuǎn)速和時(shí)間均為：2000r/min、5min。（2）第1次離心時(shí)間到，用移液器吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板，加生理鹽水，吹打混勻紅細(xì)胞，配平后進(jìn)行第2次離心，依此進(jìn)行第3次離心。（3）第3次離心時(shí)間到，吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板后，讀出離心管中紅細(xì)胞的體積。

注意：吹打混勻紅細(xì)胞時(shí)不要太用力，以免破壞紅細(xì)胞。離心機(jī)的使用離心機(jī)放置平穩(wěn)離心管對(duì)稱放入離心機(jī)，使其處于平衡狀態(tài)按檔位依次升高轉(zhuǎn)速至所需速度。離心時(shí)間到，將轉(zhuǎn)速調(diào)為零，離心機(jī)停轉(zhuǎn)后方可取出離心管。

3.配制1%RBC懸液根據(jù)紅細(xì)胞的體積，計(jì)算所需生理鹽水量，用所需生理鹽水將紅細(xì)胞泥全部沖入小燒杯中，搖勻即可。

注意：搖勻時(shí)動(dòng)作要輕柔，以防紅細(xì)胞破碎或液體外溢。紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒有相應(yīng)受體的紅細(xì)胞RBC血凝素纖突受體v血凝素纖突三、血凝試驗(yàn)（HA）1．基本原理孔號(hào)123456789101112病毒稀釋倍數(shù)生理鹽水標(biāo)準(zhǔn)抗原生理鹽水

1%RBC懸液

2122

23242526

272829

210211對(duì)照2525

25

25

25

25

25

25

25

2525

252525

25

25

25

25

25

25

25

2525

棄252525

25

25

25

25

25

25

25

2525

25

2525

25

25

25

25

25

25

25

2525

25

振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對(duì)照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時(shí)判定結(jié)果。2．操作術(shù)式（微量法，單位ul）

新的操作方法和舊版有哪些不同？生理鹽水、劑量、反應(yīng)條件HA試驗(yàn)結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間

病毒的HA價(jià)（血凝滴度）：能使紅細(xì)胞發(fā)生完全凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)稱為病毒的血凝價(jià)，常用nlog2或1：xxx表示。HA試驗(yàn)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（HI同）正確使用微量移液器（吸頭固定緊，每次都要排空）；吸頭不能混用；懸滴加樣；混勻要徹底；時(shí)間和溫度合適。四、4單位病毒的配制HA試驗(yàn)，測(cè)定做NDV病毒的血凝效價(jià)血凝效價(jià)除以4即為4V的稀釋倍數(shù)

用生理鹽水稀釋HA試驗(yàn)的NDV液4單位病毒液HA試驗(yàn)，測(cè)定做NDV病毒的血凝效價(jià)血凝效價(jià)除以4即為4V的稀釋倍數(shù)用生理鹽水稀釋HA試驗(yàn)的NDV液HA試驗(yàn)，測(cè)定做NDV病毒的血凝效價(jià)血凝效價(jià)除以4即為4V的稀釋倍數(shù)4單位病毒液用生理鹽水稀釋HA試驗(yàn)的NDV液HA試驗(yàn)，測(cè)定做NDV病毒的血凝效價(jià)血凝效價(jià)除以4即為4V的稀釋倍數(shù)介紹：回歸試驗(yàn)回歸試驗(yàn)用4V進(jìn)行的HA試驗(yàn)（用4個(gè)孔），用于檢驗(yàn)4V配制是否正確。

4V配制正確的判定標(biāo)準(zhǔn)：

前2個(gè)孔完全凝集，后2個(gè)孔不完全凝集，如下圖：

五、血凝抑制試驗(yàn)（HI）當(dāng)病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后，病毒凝集紅細(xì)胞的能力受到抑制，稱為病毒的血凝抑制。Ag、Ab不對(duì)應(yīng)RBC抗體紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCv血凝性病毒血凝素纖突RBC有其受體的紅細(xì)胞血凝素纖突受體RBCv血凝性病毒血凝素纖突vvvv

Ag、Ab對(duì)應(yīng)HAHIRBC紅細(xì)胞不凝集（HI現(xiàn)象）RBCvvRBCRBC1．反應(yīng)原理孔號(hào)123456789101112生理鹽水被檢血清血清稀釋倍數(shù)4V

2525

25

25

25

25

25

25

25

25

25502525

25

25

25

25

25

25

25

25

－－

棄25

212223242526272829210

病毒鹽水對(duì)照對(duì)照

2525

25

25

25

25

25

25

25

25

25

－輕叩反應(yīng)板使反應(yīng)物混合均勻，室溫即20℃～25℃下靜置不少于30min，4℃靜置不少于60min。1%RBC懸液252525252525252525252525

振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對(duì)照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時(shí)判定結(jié)果。２．HI試驗(yàn)操作術(shù)式（微量法，單位ul）注意：除被檢血清外，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各做一排。HI試驗(yàn)結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間

血清的血凝抑制價(jià)：能使4V凝集紅細(xì)胞的能力受到完全抑制的血清最大稀釋倍數(shù)稱該血清的血凝抑效價(jià)（HI價(jià)、抗體滴度、抗體效價(jià)）。請(qǐng)對(duì)左側(cè)的結(jié)果進(jìn)行抗體滴度報(bào)告結(jié)果判定（新城疫抗體測(cè)定）在生理鹽水對(duì)照孔出現(xiàn)正確結(jié)果（紅細(xì)胞完全流下）的情況下，將反應(yīng)板傾斜，從背側(cè)觀察，正確判讀被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的