分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用詳解演示文稿

分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)（優(yōu)選）分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用當(dāng)前第2頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)根據(jù)分子診斷技術(shù)特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)。當(dāng)前第3頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)二、基于測序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)DNA的序列分析是分子診斷學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，各種遺傳疾病，病毒或細(xì)菌的感染與變異，在基因表達(dá)水平上的個(gè)性化用藥，多基因疾病的診斷與預(yù)測，最終都可以借助基因測序平臺(tái)的應(yīng)用。當(dāng)前第4頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)三、基于擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴(kuò)增DNA成為可能，開啟了體外擴(kuò)增和操作DNA或RNA技術(shù)的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴(kuò)增DNA的技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。當(dāng)前第5頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)二、PCR概述（一）PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。當(dāng)前第6頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)

PCR技術(shù)能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述當(dāng)前第7頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史1983

Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985關(guān)于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》雜志上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。199310月13日Mullis獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1995熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)當(dāng)前第8頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)PCR技術(shù)PCR核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴(kuò)增反應(yīng)不需要每一個(gè)循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，使應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項(xiàng)突破性技術(shù)。當(dāng)前第9頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇當(dāng)前第10頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火

延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系當(dāng)前第11頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制！PCR反應(yīng)的特點(diǎn)當(dāng)前第12頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV）、弓形蟲（TOX）、風(fēng)疹病毒（RUB）其它病原體檢測：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一病原體檢測當(dāng)前第13頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽性率低、費(fèi)時(shí)2.細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(4-8W)3.血清學(xué)診斷：

a.接種BCG可出現(xiàn)陽性

b.不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人

c.交叉反應(yīng)，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！當(dāng)前第14頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)2.早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結(jié)核病當(dāng)前第15頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)3.熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。

4.TB-DNA濃度可用于判斷療效：痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對(duì)藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義當(dāng)前第16頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)二腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3、轉(zhuǎn)移抑制基因三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用當(dāng)前第17頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)三遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用當(dāng)前第18頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)四其它應(yīng)用1.法醫(yī)學(xué)鑒定2.抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)3.縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用當(dāng)前第19頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)窗口期：所謂“窗口期”,是指從感染病原體開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原體存在為止的這一段時(shí)間。美國90％以上輸血傳播HIV和HBV以及75％以上輸血HCV的危險(xiǎn)性均來自“窗口期”感染獻(xiàn)血。當(dāng)前第20頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)

提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測的臨床意義項(xiàng)目ELISA窗口期項(xiàng)目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10當(dāng)前第21頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)RNA+Ab-P24+Ab-血清陽轉(zhuǎn)后的方法RNAp24Ab血清陽轉(zhuǎn)抗體檢測臨界值

特異性抗體比例時(shí)間反應(yīng)指標(biāo)感染

血清陽轉(zhuǎn)前的方法怎樣檢測HIV早期感染?當(dāng)前第22頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)

嬰幼兒感染HIV診斷：12月內(nèi)核酸檢測，13-17月先抗體，陽性者檢測核酸，18個(gè)月以上抗體檢測當(dāng)前第23頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)四、PCR檢測的標(biāo)本采集要求

項(xiàng)目標(biāo)本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜），前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動(dòng)棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV當(dāng)前第24頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)項(xiàng)目標(biāo)本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無菌試管。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但需分離單個(gè)核細(xì)胞檢測，陽性率才會(huì)高。（于發(fā)熱時(shí)抽?。㎝P

咽拭子當(dāng)前第25頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)五、NAT（核酸檢測）技術(shù)類型：當(dāng)前第26頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（SAT）實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（SAT）是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。國內(nèi)公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù)。當(dāng)前第27頁\共有28頁\編于星期日\19點(diǎn)（SAT）技術(shù)