第四章體內(nèi)藥物分析方法的建立與驗證

第一節(jié)

分析方法的設(shè)計依據(jù)

在建立分析方法之前，應(yīng)充分利用現(xiàn)代科技成就和前人的研究成果，系統(tǒng)檢索國內(nèi)外的科技文獻，對藥物在生物體內(nèi)的存在狀況、藥代動力學(xué)參數(shù)、分析檢測方法等相關(guān)資料加以分析和研究，以供借鑒。對于尚無文獻報道的藥物，亦可參考同類藥物的相關(guān)文獻。

檢索文獻，可在最短時間、最小的花費（磨刀不誤砍柴工）建立一個好的分析方法！這是試驗前要做的第一件事！大四的同學(xué)們，你們查過文獻嗎？當(dāng)前第1頁\共有96頁\編于星期六\17點1血藥濃度94-20085122篇當(dāng)前第2頁\共有96頁\編于星期六\17點2當(dāng)前第3頁\共有96頁\編于星期六\17點3當(dāng)前第4頁\共有96頁\編于星期六\17點41992年創(chuàng)刊的《中國臨床藥學(xué)雜志》

2001年第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院主辦的《藥學(xué)服務(wù)與研究》兩刊于2004年同時成為中國科技核心期刊

臨床藥學(xué)專業(yè)性的學(xué)術(shù)期刊有：當(dāng)前第5頁\共有96頁\編于星期六\17點5不想當(dāng)將軍的士兵不是好士兵容量大的U盤：《中國臨床藥學(xué)雜志》、《藥學(xué)服務(wù)與研究》中大量的相關(guān)文獻拷貝下來另外以“臨床藥學(xué)”、“臨床藥師”、“合理用藥”、“藥學(xué)監(jiān)護”、“血藥濃度”等為關(guān)鍵詞，查找相關(guān)的文獻，copy!看文獻寫論文提職稱當(dāng)前第6頁\共有96頁\編于星期六\17點6這門課有兩個實驗，要求大家以論文的形式寫實驗報告！！實驗一改進的柱前衍生-HPLC法測定丙戊酸鈉的血藥濃度由老師提供文獻?？赐晡墨I后，考慮一個問題：該如何設(shè)計、優(yōu)化實驗條件？實驗二姜黃素-PVP固體分散體在兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)的測定大家到圖書館電子閱覽室查閱文獻！??！

關(guān)鍵詞：姜黃素，血藥濃度或：姜黃素，（藥代）動力學(xué)要看PDF文檔，電腦要安裝ADOBEREADER軟件當(dāng)前第7頁\共有96頁\編于星期六\17點7一、待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況準(zhǔn)確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物通過一定的生物樣品預(yù)處理使待測物從結(jié)合物或綴合物中釋放出來。故此，應(yīng)首先考慮樣品預(yù)處理方法 待測藥物的理化性質(zhì) 藥物在生物體內(nèi)的存在狀況 藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化(代謝)途徑建立分析檢測方法的主要依據(jù)有：當(dāng)前第8頁\共有96頁\編于星期六\17點8(一)待測藥物的理化性質(zhì)

藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等—決定預(yù)處理方法及萃取方法 具有親脂性—在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取 具有強極性或親水性—沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等 具有揮發(fā)性—GC測定法 具有光譜或電化學(xué)特性—分析檢測方法 藥物的穩(wěn)定性—萃取濃縮技術(shù) 對酸堿不穩(wěn)定—避免使用強酸或強堿性溶劑 對熱不穩(wěn)定—避免高溫蒸發(fā)溶劑---一個例子當(dāng)前第9頁\共有96頁\編于星期六\17點9另一個“兩彈一星”：拯救5億人的“中國神藥”---青蒿素

瘧疾是危害人類最大的疾病之一。全球每年瘧疾病人超過5億，死亡100萬人以上。屠呦呦：古醫(yī)書中有青蒿治療瘧疾的記錄。起初青蒿的有機溶劑提取物對瘧疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古醫(yī)書：“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之?！焙椭兴幊Ｓ玫募灏痉ú煌吭瓉砝锩嬗玫氖乔噍秕r汁！改用沸點較低的乙醚提取，抑制率達100%溫度?。。?！當(dāng)前第10頁\共有96頁\編于星期六\17點10(二)待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)與血漿蛋白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低 —決定分離萃取方法指標(biāo)：提取回收率

蛋白結(jié)合較強（非極性強）—不宜直接采用溶劑萃取？有機溶劑沒選對？吲噠帕胺、偽麻黃堿！體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物

—決定分析檢測技術(shù)

濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存） —代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定 —采用HPLC或LC-MS等分析檢測技術(shù)當(dāng)前第11頁\共有96頁\編于星期六\17點11二、分析測定的目的與要求

體內(nèi)藥物分析的目的—影響分析方法的應(yīng)用

藥代動力學(xué)—研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程—血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物

要求—同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物

檢測—寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20，4-5半衰期)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)

方法—不必強調(diào)方法的簡便、快速，按SOP，大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS建立分析檢測方法的主要依據(jù)有：當(dāng)前第12頁\共有96頁\編于星期六\17點12二、分析測定的目的與要求

臨床治療藥物監(jiān)測

藥物濃度通常在有效治療濃度范圍附近

方法—盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定，大多采用UV、RIA或EIA等。？

中毒患者的臨床搶救

藥物濃度極高

方法—不必強調(diào)方法的靈敏度，強調(diào)方法的特異性和分析速度 —大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC、GC-MS、RIA或EIA？當(dāng)前第13頁\共有96頁\編于星期六\17點13三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法 生物樣品的類型與預(yù)處理方法—決定分析方法的應(yīng)用

以血漿或血清為分析樣品

采用蛋白沉淀、溶劑萃取預(yù)處理技術(shù) —分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測

用RIA分析？FPIA法 —樣品的預(yù)處理方法可較為粗放 —經(jīng)過簡單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測定當(dāng)前第14頁\共有96頁\編于星期六\17點14四、實驗室條件 在設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法時，還應(yīng)充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。此外，還應(yīng)從方法的可行性、每個樣品測定耗時多少（10min）、操作的難易及技術(shù)要求及儀器、設(shè)備要求、費用多少等等方面加以考慮。當(dāng)前第15頁\共有96頁\編于星期六\17點15

在阿齊霉素制劑生物等效性研究過程中，血樣中阿齊霉素的濃度范圍為5ng/ml～1μg/ml，其檢測方法可采用HPLC法、LC-MS法和微生物法等數(shù)種方法。若用HPLC法來檢測該樣品，由于阿齊霉素的紫外吸收較弱，必須對樣品進行富集濃縮，則樣品的前處理方法采用液-液萃取法為佳；若用LC-MS法來檢測該樣品，則由于LC-MS儀器的靈敏度足以檢測濃度為1ng/ml以上的樣品，故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法來檢測該樣品，則樣品連蛋白也不需沉淀，直接上樣即可。

例子1當(dāng)前第16頁\共有96頁\編于星期六\17點16

當(dāng)然，用LC-MS法來檢測阿齊霉素時，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法來處理血樣，這些做法雖然行得通，但顯然它們不但增加了樣品處理的所需時間和工作量，而且增加了樣品處理的成本，因此阿齊霉素的血樣處理最好采用蛋白沉淀法。當(dāng)前第17頁\共有96頁\編于星期六\17點17

蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩(wěn)定性角度考慮，阿齊霉素遇酸不穩(wěn)定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考慮到乙腈沉淀蛋白效果優(yōu)于甲醇，且該方法阿齊霉素的回收率較高，故阿齊霉素血漿樣品的前處理方法以乙腈沉淀蛋白法為最佳。當(dāng)前第18頁\共有96頁\編于星期六\17點18

如果測定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為β-內(nèi)酰胺類抗生素，對酸穩(wěn)定，且酸有利于頭孢拉定的提取。蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。----具體問題具體分析----信息，查文獻例子2當(dāng)前第19頁\共有96頁\編于星期六\17點19第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇二、分析方法的建立 (一)

檢測條件的篩選 (二)分離條件的篩選當(dāng)前第20頁\共有96頁\編于星期六\17點20一、分析方法的選擇

體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計受多種因素影響 生物樣品中的藥物濃度—決定分析方法的首要要因素 生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少 —難以通過增加取樣量提高方法靈敏度 —通過選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求。常用分析方法的檢測限度及分離能力見表4-1當(dāng)前第21頁\共有96頁\編于星期六\17點21摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則二○○五年三月SFDA頒布（一）常用分析方法（1）色譜法：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數(shù)藥物的檢測；（2）免疫學(xué)方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)檢測；（3）微生物學(xué)方法，可用于抗生素藥物的測定。從目前發(fā)展看，生物樣品的分析一般首選色譜法，如HPLC、GC法或LC－MS、GC－MS法，這類方法靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性一般都能適應(yīng)臨床藥代動力學(xué)研究的需要，多數(shù)實驗室也具備條件，因此應(yīng)用最廣，大約90%的藥物濃度測定可以用色譜法來完成。具體選用何種分析方法應(yīng)根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、儀器條件以及借鑒文獻方法多方面因素來考慮確定。當(dāng)前第22頁\共有96頁\編于星期六\17點22二、分析方法的建立初步擬定分析方法后 進行一系列試驗工作，以選擇最佳分析條件

同時驗證分析方法的可行性，以確認(rèn)是否適用于實際生物樣品分析方法的建立步驟第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選當(dāng)前第23頁\共有96頁\編于星期六\17點23(一)檢測條件的篩選

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)—照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測定—確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度

HPLC—調(diào)整檢測器(類型、條件)、色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經(jīng)、柱長度)、流動相(組分及其配比)及其流速、柱溫、進樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等—使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間(tR)當(dāng)前第24頁\共有96頁\編于星期六\17點24(二)分離條件的篩選

在進行分離條件篩選時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下：

1．空白溶劑試驗—溶劑(方法特異性) 2．空白生物基質(zhì)試驗—(方法特異性) 3．模擬生物樣品試驗—方法效能指標(biāo) 4．實際生物樣品測試—代謝產(chǎn)物(方法特異性)當(dāng)前第25頁\共有96頁\編于星期六\17點251．空白溶劑試驗

待測藥物的非生物基質(zhì)溶液（通常為水溶液） —采用擬定的分析方法進行衍生化反應(yīng)、萃取分離等 樣品預(yù)處理（反應(yīng)試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等） —測定響應(yīng)信號（如HPLC峰面積或峰高） 考察目標(biāo) —方法的特異性 —空白值應(yīng)盡可能小，并能有效校正當(dāng)前第26頁\共有96頁\編于星期六\17點26對色譜分析法而言

—可通過改變反應(yīng)條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質(zhì)、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測器類型 —空白試劑信號應(yīng)不干擾藥物的測定（如R＞1.5）

本步驟主要考察 —需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過程，若預(yù)處理過程僅為生物樣品的提取分離，則可不進行該步驟，直接進行空白生物基質(zhì)試驗當(dāng)前第27頁\共有96頁\編于星期六\17點272.空白生物基質(zhì)試驗

空白生物基質(zhì)(blankbiologicalmatrix) —如空白血漿 —按“空白溶劑試驗”項下方法操作 考察目標(biāo)

—生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾（方法特異性） —在待測藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等)的“信號窗”內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號當(dāng)前第28頁\共有96頁\編于星期六\17點28celecoxib塞來考昔<抗關(guān)節(jié)炎藥，COX-2抑制劑>當(dāng)前第29頁\共有96頁\編于星期六\17點293.模擬生物樣品試驗

模擬生物樣品—空白生物基質(zhì)中加入待測藥物，照“空白溶劑試驗”項下方法操作

考察目標(biāo)： —方法的線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、靈敏度、 藥物的萃取回收率等各項技術(shù)指標(biāo)—同時進一步檢驗生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性當(dāng)前第30頁\共有96頁\編于星期六\17點30對色譜分析法而言

—進一步考察待測藥物、內(nèi)標(biāo)物與內(nèi)源性物質(zhì)(或其它藥物)的分離情況 —如色譜峰的tR、n和T是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分（如何確定？） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點等 均可說明內(nèi)源性物質(zhì)是否對待測藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾當(dāng)前第31頁\共有96頁\編于星期六\17點314.實際生物樣品的測試

空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗—確定的分析方法及其條件 —不能完全確認(rèn)是否適合于實際生物樣品的測定 —藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物)或代謝生成數(shù)個代謝產(chǎn)物及其進一步的結(jié)合物(或綴合物) 實際生物樣品—確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試 考察目標(biāo)：—代謝產(chǎn)物對藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況—進一步驗證方法的可行性？當(dāng)前第32頁\共有96頁\編于星期六\17點32空白血漿空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液志愿者實際樣品空白溶劑試驗多余？當(dāng)前第33頁\共有96頁\編于星期六\17點33第三節(jié)分析方法

驗證的內(nèi)容與要求

基于以下原因需要對建立的分析方法學(xué)進行驗證：1、生物樣品量少2、藥物或活性代謝產(chǎn)物濃度低3、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾4、生物的個體差異較大當(dāng)前第34頁\共有96頁\編于星期六\17點34（二）方法學(xué)確證建立可靠的和可重復(fù)的定量分析方法是進行臨床藥代動力學(xué)研究的關(guān)鍵之一。為了保證分析方法可靠，必須對方法進行充分確證，一般應(yīng)進行以下幾方面的考察：1、特異性(Specificity)2、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（CalibrationCurve）3、定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）4、精密度與準(zhǔn)確度（PrecisionandAccuracy）5、樣品穩(wěn)定性(Stability)6、提取回收率7、微生物學(xué)和免疫學(xué)方法確證8、方法學(xué)質(zhì)控摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

當(dāng)前第35頁\共有96頁\編于星期六\17點35

用于實際生物樣品分析之前： 需要驗證(validation)分析方法的可行性與可靠性 方法驗證時應(yīng)考慮影響分析方法的所有可變因素：

取樣、樣品制備、色譜分離、檢測與數(shù)據(jù)評價使用的樣品

—通常采用模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣

驗證的技術(shù)指標(biāo) —效能指標(biāo)

當(dāng)前第36頁\共有96頁\編于星期六\17點36驗證步驟

首先為分析方法的驗證 —特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率、定量限與檢測限、穩(wěn)定性等

其次為生物基質(zhì)中待測藥物穩(wěn)定性的驗證 —室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán)Freeze-and-thawcycle當(dāng)前第37頁\共有96頁\編于星期六\17點37驗證的效能指標(biāo)與基本要求

1．特異性（專屬性）—避免干擾 2．標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍—覆蓋所有濃度范圍 3．準(zhǔn)確度—與實際狀況相符 4．精密度—結(jié)果可重現(xiàn) 5．定量限—達到峰濃度的1/10～1/20 6．穩(wěn)定性—確保所有樣品準(zhǔn)確測定 7．提取回收率—確保檢測的靈敏度當(dāng)前第38頁\共有96頁\編于星期六\17點38一、方法特異性(專屬性或選擇性)

方法的特異性(specificity) —又稱專屬性或?qū)Ｒ恍裕ǔＥc選擇性(selectivity)互用 —系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力，通常表示所檢測的信號(響應(yīng))系屬于待測藥物所特有 選擇性—包括將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力

特異性—函蓋二者，以驗證所測定的物質(zhì)與待測藥物的同一性特異性用于考察方法的抗干擾程度。如果特異性不佳，方法的準(zhǔn)確度、精密度、線性都將受到影響。因此確保特異性是建立和驗證一個分析方法的第一步。

當(dāng)前第39頁\共有96頁\編于星期六\17點391.內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

比較—待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物的對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品） —空白生物基質(zhì) —模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對照品）的檢測信號 —如HPLC色譜峰的tR、n和拖尾因子（T）是否一致，以及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的分離度（R） 確證—內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾考察一個分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點：當(dāng)前第40頁\共有96頁\編于星期六\17點402.代謝產(chǎn)物的干擾

比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號 如HPLC中藥物色譜峰的tR、n和T是否一致，〔或改變色譜條件(色譜柱)再比較〕，以及與代謝產(chǎn)物的R，來確證代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾。

結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測定 －通過HPLC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性

對于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測定 －采用LC-LC-NMR進行結(jié)構(gòu)的初步推測后，考察其干擾情況。當(dāng)前第41頁\共有96頁\編于星期六\17點41對于色譜法至少要考察6個不同個體的空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖，以反映分析方法的特異性。對于以軟電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的檢測法（LC-MS、LC-MS-MS）應(yīng)注意考察分析過程中的介質(zhì)效應(yīng)，如離子抑制等。摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

當(dāng)前第42頁\共有96頁\編于星期六\17點423.伍用藥物的干擾

TDM時 —還要考慮患者可能同時服用藥物的干擾 通過比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號 如HPLC色譜峰的tR、n和T是否一致

來確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況當(dāng)前第43頁\共有96頁\編于星期六\17點434.與參比方法的相關(guān)性

除上述方法外，有時還可使用參比方法對照法。 參比方法一般選用特異性強、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好的色譜法。如在TDM中使用UV(或RIA)時,可以HPLC(或GC)為參比 參比方法測定結(jié)果為橫坐標(biāo)(X);擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y) 用最小二乘法計算回歸方程Y＝a＋bX(坐標(biāo)標(biāo)度相等)、相關(guān)系數(shù)(r)—表示兩種方法測得結(jié)果的一致性，若r≠1，表示擬定方法為非線性，如RIA中抗血清滴度選擇不當(dāng)當(dāng)前第44頁\共有96頁\編于星期六\17點444.與參比方法的相關(guān)性

Y＝a＋bX截距(a)—表示擬定方法受到恒定干擾的程度—內(nèi)源性物質(zhì)(UV) 斜率(b)—表示擬定方法受到比例干擾的程度—標(biāo)記抗原不純(RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較，除顯示分析方法的特異性外，還反映分析方法的準(zhǔn)確度。 —斜率b表示兩種方法測得結(jié)果的一致性

若參比方法準(zhǔn)確度良好，且截距a≈0,則擬定方法的準(zhǔn)確度(回收率)為100b(%)當(dāng)前第45頁\共有96頁\編于星期六\17點45二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）—校正（calibrationcurve）or工作（workingcurve） —指生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)（峰面積或峰高）的相關(guān)性（呈比例的程度） —通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價 —除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式 —常用的回歸分析法為最小二乘法（leastsquares）或加權(quán)最小二乘法（weightedleastsquares） 線性范圍（linearrang）—標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 —在此線性范圍內(nèi)，模擬生物樣品的測定結(jié)果應(yīng)達到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度當(dāng)前第46頁\共有96頁\編于星期六\17點46二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍(續(xù))

標(biāo)準(zhǔn)曲線—用模擬生物樣品建立 —線性范圍(不包括零點)應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 —不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備當(dāng)前第47頁\共有96頁\編于星期六\17點47標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立過程：標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備、測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制加權(quán)最小二乘法限度要求當(dāng)前第48頁\共有96頁\編于星期六\17點48標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法

1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)－對照品、標(biāo)準(zhǔn)品 溶劑—水或甲醇（或其他適當(dāng)溶劑） 濃度—模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上 加入量為生物樣品總體積的2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異。難溶性藥物，濃度較低—應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì)結(jié)晶？否則,在實際樣品測定時應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻

當(dāng)前第49頁\共有96頁\編于星期六\17點49

至少含5～8個濃度點(不包括零點，即空白) —可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常數(shù)約為2) 若體內(nèi)平均達峰濃度為50，其1/20為2.5 設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1(個體差異)當(dāng)前第50頁\共有96頁\編于星期六\17點502、內(nèi)標(biāo)溶液的制備內(nèi)標(biāo)物質(zhì)－對照品、標(biāo)準(zhǔn)品或化學(xué)試劑適宜的溶劑－甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度－與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的中間濃度相當(dāng)如：某標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，則內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)配制成40μg/ml

在這里，加內(nèi)標(biāo)溶液時并沒有象標(biāo)準(zhǔn)溶液那樣要求加入量為生物樣品總體積的2%以下，為什么？當(dāng)前第51頁\共有96頁\編于星期六\17點513.標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備

空白生物基質(zhì)(如血漿)—加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品的最高濃度應(yīng)高于生物體用藥后的達峰濃度，最低濃度應(yīng)低于Cmax的10％～5％。目的—涵蓋 為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時造成的損失？ ——①先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液②再加入空白生物基質(zhì) ③渦旋混勻

①②③當(dāng)前第52頁\共有96頁\編于星期六\17點524.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以待測藥物的檢測響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高)或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量,y)對模擬血藥濃度(自變量,x) —求得回歸方程(y＝a＋bx)及其相關(guān)系數(shù)() 在一組由至少7個濃度(不包括零點)構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，至多可有2個濃度點數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如： （1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問題；（3）顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線 —其余應(yīng)有至少5個濃度點在標(biāo)準(zhǔn)曲線上當(dāng)前第53頁\共有96頁\編于星期六\17點535.加權(quán)最小二乘法

普通最小二乘法—每個濃度點絕對誤差(yi－yi’)賦予同等的重要性

若標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達102) —低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求。加權(quán)最小二乘法—回歸計算時增加一個權(quán)重因子(w) —各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對離差平方和達到最小式中，wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第i個濃度點的權(quán)重因子當(dāng)前第54頁\共有96頁\編于星期六\17點541）回歸方程(y=a+bx)參數(shù)的計算

現(xiàn)在有專業(yè)軟件當(dāng)前第55頁\共有96頁\編于星期六\17點552）權(quán)重因子的選擇 選擇加權(quán)因子時—兼顧考慮曲線上高、中、低各濃度點的準(zhǔn)確度，賦予低濃度點以更大的權(quán)重 在實際工作中的一般方法 （1）當(dāng)wi=1/(yi’)2時，則 （2）而yi與xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 當(dāng)高濃度點測量值的準(zhǔn)確度下降過大 低濃度點權(quán)重過大，降低低濃度點的權(quán)重，wi=k/xi當(dāng)前第56頁\共有96頁\編于星期六\17點56標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求

—標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個濃度(通常為5～8個濃度,不包括零點)—最高濃度應(yīng)高于用藥后生物體內(nèi)藥物的達峰濃度(Cmax)，最低濃度應(yīng)為方法的LOQ(非LOD)，并應(yīng)低于Cmax的10％～5％（1/10-1/20）—若標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍較寬，可分為高低兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)間不少于5個濃度)，分別加權(quán)回歸—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200—相關(guān)系數(shù)要求≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學(xué)方法)—回歸方程的截距應(yīng)接近于零，b≥1使之具有較高的靈敏度--與坐標(biāo)的標(biāo)度選擇有關(guān)在藥代動力學(xué)或生物利用度研究中：當(dāng)前第57頁\共有96頁\編于星期六\17點57三、準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確度(accuracy)—系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度 理論上應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的。所以，通常使用模擬生物樣品測定，以測得的濃度與添加的理論濃度比較計算求得。 一般用相對回收率(relativerecovery，RR)或相對誤差(relativeerror，RE)表示當(dāng)前第58頁\共有96頁\編于星期六\17點581.測定法

取空白生物基質(zhì)（如血漿）數(shù)份，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法操作，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控(qualitycontrol，QC)樣品 —高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3個濃度 —每一濃度至少5個樣本 —與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得的濃度當(dāng)前第59頁\共有96頁\編于星期六\17點592.結(jié)果計算與限度要求

計算 —測定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求 —相對回收率應(yīng)在85%～115%(LOQ附近80%～120%) —RE在±15%(LOQ附近為±20%)當(dāng)前第60頁\共有96頁\編于星期六\17點60四、精密度

方法精密度(precision) —系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度 —表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility) —反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一 理論上，精密度應(yīng)使用實際生物樣品測定。但實際上生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.5～2ml) —使用模擬生物樣品測定，且通常與方法準(zhǔn)確度評價同時進行，如日內(nèi)精密度即可使用方法準(zhǔn)確度的測定數(shù)據(jù)計算。當(dāng)前第61頁\共有96頁\編于星期六\17點611.表示方法

方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation，SD)或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示SD= RSD= =在體內(nèi)藥物分析中，方法精密度一般用RSD表示。當(dāng)前第62頁\共有96頁\編于星期六\17點62批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD系指在同一分析批內(nèi)測定結(jié)果之間的RSD。一個分析批通常在一個工作日內(nèi)完成，又稱為日內(nèi)(within-day)RSD。

無論是藥代動力學(xué)試驗或治療藥物監(jiān)測監(jiān)測，通常在一個工作日內(nèi)難以完成全部樣品的分析。在不同工作日之間的實驗條件有可能發(fā)生微小變化，對分析結(jié)果有可能產(chǎn)生影響。所以，方法精密度除要考察批內(nèi)RSD外，同時還有考察批間RSD。

批間(between-run或inter-assay)RSD系指在不同分析批的測定結(jié)果之間的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日內(nèi)完成，又稱為日間(between-day，day-to-day)RSD。當(dāng)前第63頁\共有96頁\編于星期六\17點632.測定法—分別測定法(Ⅰ)

取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，照準(zhǔn)確度項下方法，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低3個濃度的QC樣品，并分析測定批內(nèi)RSD：一個工作日內(nèi)完成，隨行制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度5～6個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算3個濃度的RSD批間RSD：在至少5個工作日內(nèi)完成，每一工作日內(nèi)完成一個分析批的測定。每一分析批內(nèi)制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算3個濃度(每一濃度5～6個分析批數(shù)據(jù))的RSD當(dāng)前第64頁\共有96頁\編于星期六\17點642.測定法

若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進行3個批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為5～6個樣本)—采用多次分析的方差分析法 批間RSD= 批內(nèi)RSD= =批內(nèi)與批間RSD當(dāng)前第65頁\共有96頁\編于星期六\17點653.限度要求

在藥代動力學(xué)和生物利用度研究中

對g/ml級水平的RSD一般應(yīng)≤10% ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)≤15% 在LOQ附近RSD應(yīng)≤20%。

當(dāng)前第66頁\共有96頁\編于星期六\17點66五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度(sensitivity) —標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(最低濃度點≥LOQ)

要求—應(yīng)能滿足測定3～5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax的10％～5％ —準(zhǔn)確度在80%～120%(或RE在±20%的范圍內(nèi)) —RSD≤20%當(dāng)前第67頁\共有96頁\編于星期六\17點67最低檢測限（limitofdetectionLOD）：是指可在噪音水平下識別生物樣品中藥物的最低濃度，一般認(rèn)為信噪比（S/N）≥3，信號可被檢測，故以S/N＝3時的樣品濃度作為LOD。LOQ的檢測信號至少是LOD的2倍以上，以（S/N）＝10作為LOQ的估計值。當(dāng)前第68頁\共有96頁\編于星期六\17點68LODTestS/N＝3當(dāng)前第69頁\共有96頁\編于星期六\17點69六、穩(wěn)定性生物樣品量較大時，在一個工作日內(nèi)難以完成全部樣品的分析；有時樣品需進行復(fù)測。因此生物樣品及其預(yù)處理后的殘渣或溶液的穩(wěn)定性就顯得尤為重要。需要對樣品的存放條件和時間進行考察，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠方法穩(wěn)定性

生物樣品的穩(wěn)定性穩(wěn)定性當(dāng)前第70頁\共有96頁\編于星期六\17點70（一）方法穩(wěn)定性：首先考察待測藥物的標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)、衍生化試劑）或其分析溶液在實驗室溫度、濕度、光照及暴露空氣等條件下的穩(wěn)定性；在分析方法的建立時要考慮模擬生物樣品的預(yù)處理過程（提取、凈化及相轉(zhuǎn)移）及待測物（蒸干后的殘渣及其溶液）在室溫或冰箱中存放的穩(wěn)定性。當(dāng)前第71頁\共有96頁\編于星期六\17點71短期穩(wěn)定性：主要考察模擬生物樣品在室溫、4℃或－20℃以及凍－融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性（二）生物樣品的穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性：主要考察生物樣品長期冰凍（－20℃或－80℃）后的穩(wěn)定性，考察期限從生物樣品的采集到分析完畢的整個時間區(qū)間。當(dāng)前第72頁\共有96頁\編于星期六\17點72測定方法與要求1、取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時間后，每個樣品重復(fù)測定三次，平均值應(yīng)為零時測定的±5％以內(nèi)（經(jīng)衍生化處理±15％以內(nèi)）。若考察時間大于1天，則應(yīng)與新制QC樣品比較，若考察時間很長，可與在液氮中保存的樣品在相同條件下的測定值比較2、穩(wěn)定性期限要求室溫下存放一般僅考察1個工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中－數(shù)個工作日（或數(shù)星期、數(shù)月）當(dāng)前第73頁\共有96頁\編于星期六\17點73七、萃取回收率（Extactionrecovvvery）

從生物樣品基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值與加入的標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值的百分比即為分析物的萃取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物萃取出來供分析的比例。

應(yīng)考察高、中、低3個濃度的萃取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)當(dāng)前第74頁\共有96頁\編于星期六\17點741.測定法

取空白生物基質(zhì)(如血漿)，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次 另取等量的相同3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定

AT—經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測信號或比值(內(nèi)標(biāo)法) AS—未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測信號或比值(內(nèi)標(biāo)法)當(dāng)前第75頁\共有96頁\編于星期六\17點75實驗過程中的注意事項1、要考察是內(nèi)源性物質(zhì)還是提取方法對提取回收率產(chǎn)生影響2、測定回收率時，如采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)應(yīng)在提取之后，溶劑蒸發(fā)之前加入3、采用內(nèi)標(biāo)法定量時，應(yīng)同時測定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率，只需配制一個中間濃度的QC樣品5份，同法測定。當(dāng)前第76頁\共有96頁\編于星期六\17點762.限度要求在生物利用度或TDM時高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應(yīng)≥70%高、中濃度的RSD應(yīng)≤15%低濃度的RSD應(yīng)≤20%內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率應(yīng)≥50%（RSD≤15%)當(dāng)前第77頁\共有96頁\編于星期六\17點77

（1）方法準(zhǔn)確度(或相對回收率，relativerecovery)（2）萃取回收率(絕對回收率，absoluterecovery)萃取回收率與相對回收率的比較：（1）萃取回收率主要考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的程度損失（2）相對回收率主要用來考察測定方法的準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計算生物樣品中藥物濃度當(dāng)前第78頁\共有96頁\編于星期六\17點78有時，低濃度的回收率大大低于高濃度的回收率，其原因可能是疏水性藥物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。解決辦法：表面硅烷化處理或加入可降低吸附的試劑如異丙醇、異戊醇、乙二胺等。當(dāng)前第79頁\共有96頁\編于星期六\17點79八、質(zhì)量控制1、質(zhì)控樣品（QualitycontrolQC）：是指將已知量的待測藥物加入到空白生物基質(zhì)中配制的模擬生物樣品，用于整個分析過程中的質(zhì)量控制，一般配制高、中、低三個濃度的樣品分析方法建立并通過驗證后，方可進行實際生物樣品的測定，此時仍需對分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行監(jiān)控！質(zhì)控樣品池由不負(fù)責(zé)生物樣品測試的人員（推薦由獨立的人員）在實驗開始時制備，并與實際生物樣品在相同條件下儲存當(dāng)前第80頁\共有96頁\編于星期六\17點802、質(zhì)量控制（1）測定法：在測定過程中，每批生物樣品都應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨行間隔以高→低或低→高測定高、中、低至少3個濃度的6個QC樣品（2）限度要求：6個QC樣品中至少4個的測定結(jié)果的準(zhǔn)確度在各自正常濃度80％～120％，RSD≤20%，允許有2個QC樣品超出各自的±20％當(dāng)前第81頁\共有96頁\編于星期六\17點81由于生物基質(zhì)中存在內(nèi)源性的該物質(zhì)，難以測定方法的LOQ和準(zhǔn)確度，此時可通過以下方法制備空白生物基質(zhì)：1、對生物基質(zhì)進行處理---活性炭濾過、透析2、使用不含內(nèi)源性物質(zhì)的生物基質(zhì)—周期性變化的內(nèi)源性物質(zhì)如某些激素。3、使用替代基質(zhì)—如兔血漿、人血清蛋白、緩沖液九、生物樣品測定中其它情況（一）作為外源性藥物使用的內(nèi)源性物質(zhì)的測定當(dāng)前第82頁\共有96頁\編于星期六\17點82出現(xiàn)以下情況時，分析方法需進行再評價或交互驗證：1、改變色譜條件或生物樣品的處理方法－樣品的前處理方法改變后需要對效能指標(biāo)進行重新考察2、改變生物基質(zhì)不同物種的同種生物基質(zhì)（大鼠血漿人血漿）、同一物種的不同生物基質(zhì)（血漿血清）、甚至使用相同基質(zhì)而使用不同抗凝劑等。（二）方法的再評價或交互驗證：當(dāng)前第83頁\共有96頁\編于星期六\17點83（三）實際濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的處理：1、濃度高于定量上限－取樣品用空白基質(zhì)稀釋，同時制備高于定量上限的QC樣品，同法稀釋后測定，以確認(rèn)稀釋的有效性。2、濃度低于LOQ－增加生物樣品的體積，使測定液的濃度高于LOQ。應(yīng)在相同條件下制備QC樣品和增加體積后的空白生物基質(zhì)進行試驗，以確認(rèn)方法的準(zhǔn)確度、精密度和特異性符合要求。當(dāng)前第84頁\共有96頁\編于星期六\17點84第四節(jié)體內(nèi)藥物分析方法

應(yīng)用示例

第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究

一、文獻調(diào)研 在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。

當(dāng)前第85頁\共有96頁\編于星期六\17點85藥動學(xué)參數(shù)吸收過程—空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%～70%Cmax—口服500mg后平均Cmax為2.4～2.6mg/LTmax—1～2hT1/2—血中T1/2約為4h，腎功能減退時稍有延長至6h蛋白結(jié)合率—20%～40%代謝—口服給藥24h內(nèi)，40%～50%原形、15%代謝物經(jīng)腎排出當(dāng)前第86頁\共有96頁\編于星期六\17點86體內(nèi)分析方法

RP-HPLC 色譜柱—ODS色譜柱 流動相—甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)緩沖液(三乙胺調(diào)節(jié)pH2.3～3.5)，或離子對色譜:溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨) 檢測—紫外或熒光檢測

生物樣品預(yù)處理 蛋白沉淀法—甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進樣 溶劑萃取法—二氯甲烷-異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑 蛋白沉淀-溶劑萃取—乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-異丙醇提取

當(dāng)前第87頁\共有96頁\編于星期六\17點87二、分析方法設(shè)計

1．分析方法 血漿蛋白結(jié)合率低(20%～40%)、以原形從腎排泄 生物等效性研究—測定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度-時間曲線。初步擬定：采用RP-HPLC法

2．檢測方法 紫外—靈敏度＜1ng，若取血漿0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l進樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng/ml以上，當(dāng)Cmax在2g/ml以上(口服500mg)時基本可滿足生物等效性研究