牛乳中A型β-酪蛋白（A奶）檢測技術(shù)規(guī)程

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）檢測技術(shù)規(guī)程范圍本標準規(guī)定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測方法。本標準適用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T19495.2—2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求GB/Z35959—2018液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法通則術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2β-酪蛋白由224個氨基酸（含有15個氨基酸的信號肽）組成，具有不同的變體型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I），當?shù)?1位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分別為谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸時，稱為A2型β酪蛋白。A2奶A2milk所含β酪蛋白為A2型的牛奶稱為A2奶。質(zhì)譜法Massspectrometry；MS試樣被電離后，形成不同質(zhì)荷比的離子，根據(jù)這些離子的質(zhì)量數(shù)和相對豐度分析試樣的方法。質(zhì)荷比Mass-to-chargeratio離子的質(zhì)量m與其所帶的電荷數(shù)z之比，以m/z表示。檢測原理β-酪蛋白變體型對應(yīng)不同的氨基酸突變位點（p.51E＞K、p.52E＞K、p.82P＞H、p.103L＞I、p.108M＞L、p.121H＞Q、p.137S＞R、p.167P＞L）（參考序列：GenBankAAA30431.1），而不同氨基酸之間存在分子量差異。利用質(zhì)譜分析技術(shù)，根據(jù)質(zhì)荷比差異將樣品蛋白質(zhì)中存在氨基酸突變的肽段鑒定出來，從而確定氨基酸突變位點，實現(xiàn)對不同變體型β-酪蛋白檢測的目的。主要試劑配制實驗所用水為符合GB/T6682規(guī)定的雙蒸水；高壓滅菌條件為121℃，1.034×105Pa壓力，蒸汽滅菌20min。試劑配制見附錄A。主要儀器設(shè)備見附錄B。質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)處理參數(shù)見附錄C。檢測方法樣本采集待檢測的新鮮牛奶每頭奶牛采集新鮮牛奶（排除頭奶或末乳）50mL，充分混勻后，-80℃保存。待檢測的商品化奶粉包裝未XX，常溫儲存。蛋白提取從-80℃取出牛奶樣本，常溫解凍后充分混勻，取樣50μL，或稱取奶粉樣本30mg。向上述樣品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上裂解10min。離心，4℃，20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至終濃度55mM，暗室靜置1h。使用考馬斯藍染色法（bradford法）對蛋白質(zhì)進行定量。對定量后的蛋白質(zhì)進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）鑒定（如附錄C.1）。蛋白質(zhì)的消化每個樣品取20μg蛋白，加入到10K超濾管中，14000g，4℃，離心40min，棄廢液。加入200μL的25mM碳酸氫銨（NH4HCO3），14000g，4℃，離心40min，棄廢液。重復(fù)上述步驟兩遍。加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。離心收集消化后的肽段。真空抽干消化后的肽段。0.1%甲酸（FA）復(fù)溶肽段。質(zhì)譜鑒定將肽段上機檢測。使用Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀檢測肽段信號，液相及質(zhì)譜檢測參數(shù)詳見附錄C表C.1、表C.2、表C.3。質(zhì)譜掃描完畢，得到質(zhì)譜原始文件。將質(zhì)譜原始文件輸入到PD（ProteomeDiscoverer1.3，Thermo）軟件后，篩選質(zhì)譜譜圖。篩選參數(shù)見附錄C表C.4。PD提取后的譜圖用Mascot軟件進行搜索，搜索結(jié)束后，PD軟件根據(jù)Mascot軟件搜索結(jié)果輸出鑒XX果。檢索參數(shù)見附錄C表C.5，鑒定的肽段見附錄C表C.6。結(jié)果判定SDS鑒定將從樣品中提取的蛋白質(zhì)進行SDS分離鑒定，檢測蛋白條帶是否清晰無降解。條帶清晰，表示可用于后續(xù)檢測，否則重新取樣鑒定。見附錄C.1。A2型β-酪蛋白的判定根據(jù)質(zhì)譜鑒XX果，當待測樣品的8個氨基酸突變位點分別為p.51E、p.52E、p.82P、p.103L、p.108M、p.121H、p.137S、p.167P時，檢測結(jié)果表述為“A2奶”（如圖1）。下劃線標出的氨基酸為不同變體型β-酪蛋白中存在突變的位點，實線框內(nèi)為氨基酸突變類型A2型β-酪蛋白對應(yīng)的氨基酸序列廢棄物的處理按照GB/T19495.2—2004的規(guī)定執(zhí)行。檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2—2004的規(guī)定執(zhí)行。

（資料性附錄）

主要試劑配制樣品裂解液將480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L。10%SDS將10g的SDS粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL。30%丙烯酰胺將29g丙烯酰胺和1gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60mL的蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL。1.5MTris-HCl（pH8.8）將181.65gTris溶于800mL蒸餾水中，加濃鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至1000mL。1MTris-HCl（pH=6.8）將121.1gTris溶于800mL蒸餾水中，加濃鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至1000mL。10%過硫酸銨將10g過硫酸銨粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL?？捡R斯亮藍染色液準確量取甲醇45mL，蒸餾水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考馬斯亮藍R-250?？既久撋?0mM碳酸氫銨/乙腈=1:1。1μg/μL胰蛋白酶將100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mM乙酸中，-70℃儲存。25mM碳酸氫銨將2.0g碳酸氫銨溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L。

（資料性附錄）

主要儀器設(shè)備單道可調(diào)移液器2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL。離心機最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×1.5mL。電子天平量程0.001～100g，感量0.001g。凝膠成像分析系統(tǒng)有效像素1280×1024，檢測靈敏度DNA≥0.05ng。穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。垂直電泳槽外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝膠板面積10cm×10cm。高壓滅菌鍋使用溫度范圍45～135℃，最高使用壓力0.255Mpa。自動雙重純水蒸餾器功率3000W，出水量2500mL/h。微波爐功率700W，容積20L，尺寸262mm×452mm×365mm。冰箱4℃，-20℃。電熱恒溫水浴鍋RT+5～70℃。

（資料性附錄）

蛋白檢測參數(shù)及結(jié)果SDS鑒XX果SDS檢測結(jié)果（實線框內(nèi)條帶為β-酪蛋白）質(zhì)譜檢測主要儀器參數(shù)質(zhì)譜儀：ThermoQ-Exactive納升液相：Dionexultimate3000nanoLCsystem質(zhì)譜檢測-納升液相色譜柱及流動相項目參數(shù)NanoLCtrapAcclaimPePmap100150μm×2cmnanoviperC185μm100?NanoLCcolumnC185μm75μm×15cm孔徑300?SolventA0.1%formicacid2%ACN98%waterSolventBFlowrate0.1%formicacid2%water98%ACN0.4μL/min質(zhì)譜檢測-NanoLC液相梯度時間（分）B液比例01040454855586565.015%5%30%60%80%80%5%5%STOP質(zhì)譜檢測-Q-E質(zhì)譜儀參數(shù)參數(shù)名稱參數(shù)值離子模式（Polarity）正離子模式母離子掃描范圍（MSScanrange）350-2000m/z二級分辨率（Resolution）17500毛細管溫度（Capillarytemperature）320度離子源電壓（Ionsourcevoltage）碎裂模式（MS/MSacquisitionmodes）1800VHighercollisionenergydissociation（HCD）碰撞能量歸一化（normalizedcollisionenergy（NCE））28質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理參數(shù)譜圖篩選參數(shù)參數(shù)名稱實驗選項母離子質(zhì)量范圍350-6000Da二級質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)10信噪比S/N域值1.5鑒定檢索參數(shù)參數(shù)名稱Parameter實驗選項Mascot版本號（MascotVersion）固定修飾（Fixedmodification）Carbamidomethyl（C）可變修飾（Variablemodification）Oxidation（M），Gln→Pyro-Glu（N-termQ）Phospho（ST），Ser→Arg（S），Ser→Lys（S），Arg→Cys（R），Gln→Glu（Q），Glu→Lys（E），Met→Leu（M），Pro→His（P），Pro→Leu（P），His→Gln（H）一級質(zhì)量偏差（peptidetol.）15ppm二級質(zhì)量偏差（MS/MStol）最大允許漏切數(shù)（Maxmissedcleavages）20mmu1酶的類型（Enzyme）Trypsin數(shù)據(jù)庫（Database）Uniprot_Bostaurus（序列數(shù)：32205）蛋白肽段質(zhì)譜圖以檢測到的肽段VMGVSKVKE（107位-115位）為例，肽段中N端碎片離子為b離子模式，C端碎片離子為y離子模式，b2代表肽段中N端前兩個氨基酸組成的碎片離子，上、下質(zhì)譜圖（圖C.2）中b2分子量差值18也是甲硫氨酸（149.2）和亮氨酸（131.2）的分子量差值，因此根據(jù)二級質(zhì)譜圖分析，上圖為含氨基酸突變（p.108M＞L）的肽段。其它肽段質(zhì)譜圖略。蛋白肽段質(zhì)譜圖肽段鑒XX果靶標蛋白肽段鑒定列表（其中小寫字母代表修飾/突變位點）肽段序列修飾/突變FQsEEQQQTEDELQDKS3（Phospho）FQSEEQQQTEDELQDKDMPIQAFLLYQEPVLGPVRFQsEEQqQTEDELQDKS3（Phospho）;Q7（Gln->Glu）KIEKFqsEEQQqtEDELQDKQ6（Gln->Glu）;S7（Phospho）;Q12（Gln->Glu）;T13（Phospho）DMPIqAFLLYQEPVLGPVRQ5（Gln->Glu）FqsEEqQqtEDELQDKQ2（Gln->Glu）;S3（Ser->Arg）;Q6（Gln->Glu）;Q8（Gln->Glu）;T9（Phospho）IEKFQsEEQQQTEDELQDKS6（Phospho）表C.6靶標蛋白肽段鑒定列表（其中小寫字母代表修飾/突變位點）（續(xù)）肽段序列修飾/突變IEKFqsEEQqQtEDELQDKQ5（Gln->Glu）;S6（Phospho）;Q10（Gln->Glu）;T12（Phospho）VLPVPQKAVPYPQRDMPIqAFLLYqEPVLGPVRQ5（Gln->Glu）;Q11（Gln->Glu）DMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIVIHPFAqTqsLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLqPEVMGVSKQ6（Gln->Glu）;Q8（Gln->Glu）;S9（Ser->Lys）;Q41（Gln->Glu）IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNsLPqNIPPLTQT