Sds-page電泳過程解析

Sds電泳培訓(xùn)資料培訓(xùn)人：劉小強(qiáng)Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運(yùn)用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!2.實(shí)驗(yàn)原理帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!3.實(shí)驗(yàn)試劑

水：當(dāng)天純化水A液：B液：C液：1%SDS(要配置成10%的母液)D液：E液：10%AP:F液：TEMED

染色液：考馬斯亮藍(lán)（先用50ML的乙酸溶解再加甲醇和水）

脫色液：50ML的乙酸+200ML的甲醇+250ML水

Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!6.制膠將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干

把玻璃板在灌膠支架上固定好.

※固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.按比例配好分離膠,用移液管快速加入※凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.※水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡

※凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.

倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘.

※樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.

Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!8.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在塑料盒內(nèi)，加入染色液，染色過夜。

脫色：染色后的凝膠，棄掉染色液，加入脫色液在搖床上再脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。

※剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：凝膠成像系統(tǒng)Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!2.樣品如何處理？

根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。

3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來使用。Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!5.“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

7.為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。

8.為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!12.為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

處理辦法：電泳槽正確裝配即可。

13.濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？

這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。

14.凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快，怎么回事？

通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。

15.電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)？

可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。

Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!4.器材JUNYI-1600電源BOI-RAD電泳槽5.技術(shù)參數(shù)250V電壓

濃縮膠使用15MA電流（每塊膠），分離膠使用30MA電流

電泳時(shí)間：在溴酚藍(lán)跑到濃縮膠和分離膠交界的地方調(diào)高電流繼續(xù)電泳，等溴酚藍(lán)跑的玻璃板底部停止。Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!7.樣品處理

把樣品稀釋到合適濃度，按樣品和樣品緩沖液3:1的比例加入MARKER10UL水+1ULMARKER+5UL還原BAFFUR沸水煮5分鐘，離心8000RPM/5分鐘，然后上樣Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!SDS電泳過程中影響結(jié)果的因素：1.配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？

在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。

所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。

Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!3.SDS電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

4.提高SDS電泳分辨率的途徑？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)》P82-103。

Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!9.什么是“鬼帶”，如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

10.為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

11.為什么電泳的條帶很粗？

電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；

Sds電泳過程解析共15頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!思考題：在不連續(xù)體系SDS中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么?電極緩沖液中甘氨酸的作用?SDS中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸，電泳開始后，HCL解離成氯