工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生

上選修課的要求：1.自己上課過(guò)程中產(chǎn)生的垃圾必須要帶走2.上課過(guò)程中會(huì)隨機(jī)點(diǎn)名，無(wú)故缺勤者一次扣10分。3.有作業(yè)時(shí)，晚上以班級(jí)為單位上交，文科同學(xué)復(fù)印下選修3內(nèi)容的部分4.值日生安排選修3目錄中不要求內(nèi)容：第一章第四節(jié)去除第二章第一節(jié)去除第四章整章去除第五章第三節(jié)、第四節(jié)去除關(guān)于“現(xiàn)代生物科技”的學(xué)習(xí)——引言生物科技經(jīng)歷微觀(guān)和宏觀(guān)兩方面的發(fā)展遺傳工程與基因工程的關(guān)系“遺傳工程”泛指把一種生物的遺傳物質(zhì)（細(xì)胞核、染色體脫氧核糖核酸等）移到另一種生物的細(xì)胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)。蘇云金桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉變異類(lèi)型：操作水平：意義：基因重組DNA分子水平1）基礎(chǔ)理論研究方面：在基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控等方面有重要意義2.）生產(chǎn)實(shí)踐方面：a.定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類(lèi)所需要的品種。b.實(shí)現(xiàn)種間遺傳物質(zhì)的交換（克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙、或克服生殖隔離）

“基因工程”的核心：構(gòu)建重組DNA分子基因工程形成的是新品種。蘇云金桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉蘇云金桿菌可以合成毒蛋白想一想：要讓棉花細(xì)胞合成毒蛋白，要把蘇云金桿菌內(nèi)的什么物質(zhì)轉(zhuǎn)移到棉花細(xì)胞？為什么？棉花細(xì)胞受體細(xì)胞把蘇云金桿菌的毒蛋白基因轉(zhuǎn)移到棉花細(xì)胞，讓棉花合成毒蛋白。為什么毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)后合成的仍然是毒蛋白？共用一套密碼子1.“DNA是遺傳物質(zhì)”的發(fā)現(xiàn)2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立及遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定基因工程的理論基礎(chǔ)毒蛋白基因（DNA）目的基因我們面對(duì)的問(wèn)題？蘇云金桿菌毒蛋白抗蟲(chóng)棉1.DNA分子太長(zhǎng)（所含基因多，如人的一個(gè)DNA分子中含有上千個(gè)基因），不易操作2.DNA分子易被水解基因剪刀:限制性核酸內(nèi)切酶運(yùn)輸工具：載體基因的針線(xiàn)：DNA連接酶工具酶僅指限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，不包含載體。注意：基因工程中的工具與工具酶的區(qū)別解決培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟需要的工具：基因的剪刀：基因的針線(xiàn)：基因的運(yùn)輸工具：載體，將外源基因運(yùn)送到細(xì)胞（受體細(xì)胞）中，并保證目的基因表達(dá)和復(fù)制。DNA連接酶限制性核酸內(nèi)切酶基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。DNA分子的直徑只有2.0nm（粗細(xì)只有頭發(fā)絲的十萬(wàn)分之一），要在如此細(xì)小的DNA分子上進(jìn)行剪切和拼接，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，必須要有專(zhuān)門(mén)的工具。一、基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶2、功能

特點(diǎn)：能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊（脫氧）核苷酸序列的酶。3、結(jié)果：專(zhuān)一性，即一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)將DNA分子切斷。（注意切割外來(lái)的DNA而不切割自身的DNA）產(chǎn)生粘性末端1、來(lái)源：在細(xì)菌等微生物內(nèi)。種類(lèi)很多。切割的本質(zhì)：在特定位點(diǎn)水解磷酸二酯鍵EcoRⅠ切割DNA的實(shí)例A磷酸二酯鍵1‘2’3‘4’5‘1‘2’3’4‘5’GAATTGCCTTAAG3’3’5’5’AATTGCCTTAAGEcoRⅠ氫鍵可以自發(fā)斷裂和形成請(qǐng)分別說(shuō)出上述兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)？回文序列

書(shū)寫(xiě)重播5’3’5’3’大腸桿菌中EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶的作用過(guò)程限制性核酸內(nèi)切酶切一次形成幾個(gè)粘性末端？產(chǎn)生的2個(gè)粘性末端具有什么關(guān)系？

什么叫粘性末端？當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶從識(shí)別序列的特定位點(diǎn)切割后，被限制性核酸內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫粘性末端。

當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線(xiàn)處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。有信息時(shí)才需要考慮思考題：要想獲得目的基因，其必須含有幾個(gè)相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)？可產(chǎn)生幾個(gè)粘性末端？目的基因左右各一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，，產(chǎn)生4個(gè)粘性末端。目的基因限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。請(qǐng)畫(huà)出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后形成的粘性末端。DNA連接酶用EcoRⅠ切割后的某一環(huán)狀DNA分子用EcoRⅠ切割后的目的基因二、基因的針線(xiàn)——DNA連接酶1、作用:將具有末端堿基互補(bǔ)的2個(gè)DNA片段連接起來(lái)，形成重組DNA分子。2、連接的部位:是DNA骨架上的缺口（也就是建立磷酸二酯鍵，若缺乏堿基，DNA連接酶無(wú)法發(fā)揮作用）3、意義：可以將限制性核酸內(nèi)切酶切割下來(lái)的基因（DNA片段）與另外被切割開(kāi)的DNA分子連接到一起，為“基因重組提供了可能”。限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在DNA連接酶的作用下，兩種不同限制酶切割后形成的粘性末端能否連接起來(lái)？為什么？可以連接。因?yàn)橛蓛煞N不同限制酶切割后形成的粘性末端是互補(bǔ)的G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

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C

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GGC

TT

AA

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C

GEcolⅠ切割DNA連接酶在脫氧核糖與磷酸基團(tuán)之間形成

磷酸二酯鍵氫鍵自發(fā)形成DNA連接酶分為兩類(lèi)：①?gòu)拇竽c桿菌中分離得到：EcoRⅠDNA連接酶，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端之間連接。②從T4噬菌體中分離到：

T4連接酶，既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。注意不同點(diǎn)：DNA連接酶是將DNA片段的末端連接起來(lái)，形成重組DNA。DNA聚合酶是在復(fù)制過(guò)程中將一個(gè)個(gè)游離的脫氧核苷酸連接形成子鏈上。DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同和不同點(diǎn)？相同點(diǎn)：化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，都催化形成磷酸二酯鍵。三、基因的運(yùn)輸工具——載體1.作用：能將外源基因送入受體細(xì)胞。為什么不能將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化呢？2、作為載體的必要條件（特點(diǎn)）：①能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存②具有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)等3、載體種類(lèi)P4：質(zhì)粒和病毒（噬菌體、動(dòng)物病毒、植物病毒）最常用的（運(yùn)）載體－－質(zhì)粒質(zhì)粒――細(xì)菌擬核之外能自主復(fù)制的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子，是特殊的遺傳物質(zhì)，并不是細(xì)胞器（酵母菌也有）；質(zhì)粒的分布：細(xì)菌、真菌等。（注意最常用的質(zhì)粒：大腸桿菌的質(zhì)粒）質(zhì)粒應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：①在受體細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制和穩(wěn)定的保存，②有多種限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)；③具備易于檢測(cè)與篩選的標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因（如四環(huán)素的抗性基因)、具有顏色反應(yīng)的基因等；④對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害。但天然質(zhì)粒往往不能滿(mǎn)足上述要求，因此需要根據(jù)不同目的和需要，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行人工改造，現(xiàn)在所使用的質(zhì)粒幾乎都是經(jīng)過(guò)改造的。思考：質(zhì)粒兩條鏈中外側(cè)鏈要長(zhǎng)一點(diǎn)嗎？

工具酶和質(zhì)粒作為載體的發(fā)現(xiàn)為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)。

基因工程的研究歷程：1)世界上首次成功的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)，第一個(gè)人工DNA重組產(chǎn)物。2)細(xì)菌之間的性狀轉(zhuǎn)移，基因工程發(fā)展史上第一個(gè)成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)，標(biāo)志著基因工程的誕生。基本要求：1.說(shuō)出基因工程的含義并指出基因工程的主要內(nèi)容；2.說(shuō)出限制性核酸內(nèi)切酶的含義及作用特點(diǎn)；3.說(shuō)出DNA連接酶的作用4.簡(jiǎn)述質(zhì)粒的含義、特性及其在基因工程中的作用5.解釋限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒對(duì)誕生基因工程的作用說(shuō)明：對(duì)于限制性?xún)?nèi)切酶，只要求了解教科書(shū)中提到的兩種限制性核酸內(nèi)切酶的堿基識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。思考1.為目的基因的分離和重組提供技術(shù)保障的是__________和________2.什么是限制性核酸內(nèi)切酶？其化學(xué)本質(zhì)是_____。能斷裂________鍵，結(jié)果是形成_____________。1）不同的DNA用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割粘性末端不相同。2）用不同限制性核酸內(nèi)切酶切割粘性末端一定不同?！痢僚袛啵?、基因工程操作的工具酶？工具？2、質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)？最常用的載體是？3、判斷：質(zhì)粒是能復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子.4、判斷：大腸桿菌的質(zhì)粒位于擬核中，是一種細(xì)胞器。5、判斷：質(zhì)粒不是遺傳物質(zhì)，質(zhì)粒與染色體的化學(xué)本質(zhì)相同。6、判斷：DNA連接酶可將任意兩個(gè)平末端的DNA片段連接。7、判斷：限制性核酸內(nèi)切酶的作用是識(shí)別并切割目的基因×√×

√×第一節(jié)上到這里為止分析限制性核酸內(nèi)切酶的切割作用的一般方法1.將告知的識(shí)別序列補(bǔ)充為雙鏈，明確識(shí)別序列及其堿基對(duì)數(shù)2.根據(jù)切點(diǎn)畫(huà)出粘性末端3.對(duì)不同限制性?xún)?nèi)切酶的粘性末端進(jìn)行比較作答1、下面是5種限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA分子的識(shí)別序列和剪切位點(diǎn)圖（箭頭表示剪切點(diǎn)、切出的斷面為黏性末端）。限制酶1：—↓GATC—限制酶2：—CATG↓—限制酶3：—G↓GATCC—限制酶4：—CCGC↓GG—限制酶5：—↓CCATGG—下例敘述正確的是（）A．限制酶2和4識(shí)別的序列都包含4個(gè)堿基對(duì)B．限制酶3作用下形成的粘性末端包含5個(gè)堿基C．限制酶1和2切出的粘性末端相同D．限制酶1和3切出的粘性末端相同D注意：限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)不能推導(dǎo)，要看題目信息.2、某種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列AAGCTT，切點(diǎn)在A(yíng)和A之間。請(qǐng)畫(huà)出為獲得某DNA分子中某基因被該種限制性核酸內(nèi)切酶切割后所形成的粘性末端。5’3’3’5’3’5’5’3’++×1）粘性末端書(shū)寫(xiě)的規(guī)范性；2）DNA片段之間盡量分開(kāi)；3）必要的文字批注不同點(diǎn)：DNA連接酶是將不同DNA片段的末端連接起來(lái)，形成重組DNA分子。DNA聚合酶是在DNA復(fù)制過(guò)程中將一個(gè)個(gè)游離的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同和不同點(diǎn)？相同點(diǎn)：化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，都催化形成磷酸二酯鍵。與核酸有關(guān)的幾種酶的比較：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、解旋酶、DNA（水解）酶等。催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA：RNA聚合酶催化RNA合成DNA單鏈：逆轉(zhuǎn)錄酶

斷裂氫鍵的酶：解旋酶水解DNA形成單個(gè)脫氧核苷酸的酶：DNA酶圖中的高血壓相關(guān)基因作為_(kāi)_________，質(zhì)粒作為_(kāi)________,二者需用________切割后連接成重組載體，該過(guò)程與質(zhì)粒上含有________有關(guān)。重組DNA分子的篩選與質(zhì)粒上含有____有關(guān)。同一種限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)

標(biāo)記基因

限制性核酸內(nèi)切酶作用后的電泳圖請(qǐng)分別說(shuō)出上述兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)？練習(xí)：基本要求：1.說(shuō)出基因工程的含義并指出基因工程的主要內(nèi)容。2.說(shuō)出限制性核酸內(nèi)切酶的含義及作用特點(diǎn)。3.說(shuō)出DNA連接酶的作用。4.簡(jiǎn)述質(zhì)粒的含義、特性及其在基因工程中的作用。發(fā)展要求：解釋限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒對(duì)誕生基因工程的作用說(shuō)明：對(duì)于限