第二章基因工程的酶學演示文稿

第二章基因工程的酶學演示文稿本文檔共114頁；當前第1頁；編輯于星期六\10點45分優(yōu)選第二章基因工程的酶學本文檔共114頁；當前第2頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第3頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第4頁；編輯于星期六\10點45分第二章基因工程的酶學基礎Enzymes本文檔共114頁；當前第5頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第6頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第7頁；編輯于星期六\10點45分(II類)限制性內切酶

限制性內切酶的存在給沒給基因工程操作帶來麻煩？限制性內切酶在基因工程操作中有哪些具體用途？本文檔共114頁；當前第8頁；編輯于星期六\10點45分首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。(II類)限制性內切酶

分離的第一個酶是HindⅡ本文檔共114頁；當前第9頁；編輯于星期六\10點45分一、限制性內切酶的基本特性

是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內切酶。（1）識別位點4—8bp，回文結構思考題1、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一個6bp的II類限制性內切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么？2、下面幾種序列中你認為哪一個（哪些）最有可能是II類限制性內切核酸酶的識別序列：GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA?為什么？本文檔共114頁；當前第10頁；編輯于星期六\10點45分（2）內切酶與識別序列的結合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結合。GAATTCCTTAAG本文檔共114頁；當前第11頁；編輯于星期六\10點45分（3）切割位點EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產生？末端EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產生？末端切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識別位點處。本文檔共114頁；當前第12頁；編輯于星期六\10點45分（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點）GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’本文檔共114頁；當前第13頁；編輯于星期六\10點45分CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTC本文檔共114頁；當前第14頁；編輯于星期六\10點45分

①連接便利（5）粘性末端的意義只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。本文檔共114頁；當前第15頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第16頁；編輯于星期六\10點45分凸出的3’端可以通過末端轉移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標記，3’末端加尾凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。本文檔共114頁；當前第17頁；編輯于星期六\10點45分識別位點的序列相同的限制性內切酶。（6）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’本文檔共114頁；當前第18頁；編輯于星期六\10點45分XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：本文檔共114頁；當前第19頁；編輯于星期六\10點45分識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（7）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。本文檔共114頁；當前第20頁；編輯于星期六\10點45分5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A本文檔共114頁；當前第21頁；編輯于星期六\10點45分二、DNA末端長度對限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。本文檔共114頁；當前第22頁；編輯于星期六\10點45分

在設計PCR引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的PCR產物，應在設計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數目。另外，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。溫馨提示——Becareful本文檔共114頁；當前第23頁；編輯于星期六\10點45分表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶

待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶

待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0限制酶待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表1：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）

本文檔共114頁；當前第24頁；編輯于星期六\10點45分

某些限制酶對同一介質中的有些位點表現出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現出不同的切割效率的現象稱作位點偏愛。三、位點偏愛（Sitepreference）本文檔共114頁；當前第25頁；編輯于星期六\10點45分

λ噬菌體DNA為48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割噬菌體中的5個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍；

某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點對酶的敏感性是不同的。如：本文檔共114頁；當前第26頁；編輯于星期六\10點45分四、在實驗室條件下進行酶切20微升反應體系本文檔共114頁；當前第27頁；編輯于星期六\10點45分五、酶切反應條件終止酶切的方法緩沖液反應溫度反應時間本文檔共114頁；當前第28頁；編輯于星期六\10點45分緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。本文檔共114頁；當前第29頁；編輯于星期六\10點45分不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數是37oC，少數要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525溫度本文檔共114頁；當前第30頁；編輯于星期六\10點45分

EcoRⅠ若反應16小時，所需酶量為正常酶切時間的1/8，即若反應時間為16小時，則所用酶量為只切1小時的1/8。

反應時間

反應時間通常為1小時或更多，許多酶延長反應時間可減少酶的用量。例如：本文檔共114頁；當前第31頁；編輯于星期六\10點45分終止酶切的方法苯酚加熱EDTA本文檔共114頁；當前第32頁；編輯于星期六\10點45分

EDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應，終止?jié)舛葹?0mM；

加熱是常用的方法，對于最佳反應溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20分鐘可使酶活性大部分喪失。

對于在80℃作用20分鐘也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。本文檔共114頁；當前第33頁；編輯于星期六\10點45分與酶切反應條件相關的兩個現象本文檔共114頁；當前第34頁；編輯于星期六\10點45分

在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱。星號（*）活性。1、星號（*）活性本文檔共114頁；當前第35頁；編輯于星期六\10點45分EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！本文檔共114頁；當前第36頁；編輯于星期六\10點45分內切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2、完全消化與局部消化123412341）、完全消化本文檔共114頁；當前第37頁；編輯于星期六\10點45分只有有限數量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。2）、局部消化123414本文檔共114頁；當前第38頁；編輯于星期六\10點45分

請確定XbaI,XhoI和KpnI位點在DNA上的相對位置。本文檔共114頁；當前第39頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第40頁；編輯于星期六\10點45分六、影響限制性內切酶活性的因素外因內因

外因是可預見和控制的，如反應條件、底物的純度（是否有雜質、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當、反應體積的選擇以及反應時間的長短等等

內因包括位點偏愛性、甲基化底物、底物的構象。構象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時的活性，如與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA本文檔共114頁；當前第41頁；編輯于星期六\10點45分從細菌DNA環(huán)化現象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現DNA復制一定有斷口。本文檔共114頁；當前第42頁；編輯于星期六\10點45分（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。本文檔共114頁；當前第43頁；編輯于星期六\10點45分（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件本文檔共114頁；當前第44頁；編輯于星期六\10點45分1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應的機理2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi本文檔共114頁；當前第45頁；編輯于星期六\10點45分4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP本文檔共114頁；當前第46頁；編輯于星期六\10點45分5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。本文檔共114頁；當前第47頁；編輯于星期六\10點45分連接酶反應的最佳溫度是37C。四、連接反應的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用4~16C。本文檔共114頁；當前第48頁；編輯于星期六\10點45分增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應溫度12.5℃。五、影響連接反應的因素10~20倍。一般14~16℃本文檔共114頁；當前第49頁；編輯于星期六\10點45分第三節(jié)DNA聚合酶(自學)一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉錄酶本文檔共114頁；當前第50頁；編輯于星期六\10點45分1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。本文檔共114頁；當前第51頁；編輯于星期六\10點45分DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較本文檔共114頁；當前第52頁；編輯于星期六\10點45分三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。本文檔共114頁；當前第53頁；編輯于星期六\10點45分①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應條件-OH5’3’dNTPs本文檔共114頁；當前第54頁；編輯于星期六\10點45分標記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交本文檔共114頁；當前第55頁；編輯于星期六\10點45分標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’3’本文檔共114頁；當前第56頁；編輯于星期六\10點45分③DNA聚合酶I對探針序列的標記缺口轉移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。本文檔共114頁；當前第57頁；編輯于星期六\10點45分5’3’外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在缺口的上一段DNA的3’一側補上一個新的核苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’本文檔共114頁；當前第58頁；編輯于星期六\10點45分純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉移一種-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記8本文檔共114頁；當前第59頁；編輯于星期六\10點45分2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶本文檔共114頁；當前第60頁；編輯于星期六\10點45分①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補平限制性內切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途本文檔共114頁；當前第61頁；編輯于星期六\10點45分3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h本文檔共114頁；當前第62頁；編輯于星期六\10點45分③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物本文檔共114頁；當前第63頁；編輯于星期六\10點45分（1）T4DNA聚合酶的性質3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性本文檔共114頁；當前第64頁；編輯于星期六\10點45分③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。本文檔共114頁；當前第65頁；編輯于星期六\10點45分5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’本文檔共114頁；當前第66頁；編輯于星期六\10點45分（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記本文檔共114頁；當前第67頁；編輯于星期六\10點45分酶切中間產生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內切酶切無dNTPs本文檔共114頁；當前第68頁；編輯于星期六\10點45分a.放射性標記的優(yōu)缺點：制作簡單、高比放射性、放射自顯影效果好。優(yōu)點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對人體有害。要求在專門實驗室操作。本文檔共114頁；當前第69頁；編輯于星期六\10點45分b.非放射性標記i）生物素標記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP酰化結合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質共價結合。本文檔共114頁；當前第70頁；編輯于星期六\10點45分純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉移法將生物素摻入DNA探針中本文檔共114頁；當前第71頁；編輯于星期六\10點45分光促生物素標記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接臂光敏基因+光照本文檔共114頁；當前第72頁；編輯于星期六\10點45分抗生物素蛋白（avidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的識別——親和素：是一種雞卵清蛋白。細菌中avidin的類似物。能與生物素特異結合的蛋白或抗體，常用：本文檔共114頁；當前第73頁；編輯于星期六\10點45分ii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標記的DNA探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒(kit)。地高辛的結合物是抗地高辛抗體。本文檔共114頁；當前第74頁；編輯于星期六\10點45分本文檔共114頁；當前第75頁；編輯于星期六\10點45分iii）偶聯酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反應，反應的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產物）。酶的作用：本文檔共114頁；當前第76頁；編輯于星期六\10點45分化學發(fā)光底物本文檔共114頁；當前第77頁；編輯于星期六\10點45分HRPO和AP的顯色反應底物本文檔共114頁；當前第78頁；編輯于星期六\10點45分發(fā)光反應機理本文檔共114頁；當前第79頁；編輯于星期六\10點45分iv）用非放射性標記的探針檢測原理生物素探針序列待測基因親和素酶底物中間產物產物發(fā)光探針DNA用生物素或地高辛標記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯。酶催化一個發(fā)光或顯色反應。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結合。本文檔共114頁；當前第80頁；編輯于星期六\10點45分核酸探針雜交篩選法的缺點是：只檢測是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達出產物。本文檔共114頁；當前第81頁；編輯于星期六\10點45分4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。本文檔共114頁；當前第82頁；編輯于星期六\10點45分（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結合就會不間斷地合成互補鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結構的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結構的阻礙本文檔共114頁；當前第83頁；編輯于星期六\10點45分②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。本文檔共114頁；當前第84頁；編輯于星期六\10點45分5.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序雙脫氧法。②標記DNA3’隱蔽末端③更有效地補平末端本文檔共114頁；當前第85頁；編輯于星期六\10點45分6.逆轉錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質由和兩條多肽鏈組成。本文檔共114頁；當前第86頁；編輯于星期六\10點45分①鏈有反轉錄活性和RNaseH活性。RNaseH：鏈經過蛋白酶水解后產生的一條多肽。以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA本文檔共114頁；當前第87頁；編輯于星期六\10點45分（3）逆轉錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA本文檔共114頁；當前第88頁；編輯于星期六\10點45分②合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結合）③RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉錄出cDNA第一鏈。本文檔共114頁；當前第89頁；編輯于星期六\10點45分第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）本文檔共114頁；當前第90頁；編輯于星期六\10點45分②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉移酶本文檔共114頁；當前第91頁；編輯于星期六\10點45分4.末端轉移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉移酶本文檔共114頁；當前第92頁；編輯于星期六\10點45分（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補平本文檔共114頁；當前第93頁；編輯于星期六\10點45分AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉移酶dTTPAAAAAA外源DNA本文檔共114頁；當前第94頁；編輯于星期六\10點45分（3）非放射性標記DNA片斷的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點HindⅢ位點連接催化非放射性標記物參入DNA片斷的3’端。（生物素-11-dUTP等）本文檔共114頁；當前第95頁；編輯于星期六\10點45分二、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。本文檔共114頁；當前第96頁；編輯于星期六\10點45分5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標記，就會被轉移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。本文檔共114頁；當前第97頁；編輯于星期六\10點45分3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應（forwardreaction）本文檔共114頁；當前第98頁；編輯于星期六\10點45分（2）交換反應標記法反應混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應效果不理想。本文檔共114頁；當前第99頁；編輯于星期六\10點45分

三、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。本文檔共114頁；當前第100頁；編輯于星期六\10點45分2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接本文檔共114頁；當前第101頁；編輯于星期六\10點45分單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’本文檔共114頁；當前第102頁；編輯于星期六\10點45分A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接