多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)導(dǎo)致DNA的增長

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)導(dǎo)致DNA的增長一、DNA分子復(fù)制的過程參與的組分在DNA復(fù)制中的作用打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸二、PCR原理PCR參與的組分在DNA復(fù)制中的作用高溫變性解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料Taq酶（耐高溫）DNA聚合酶催化合成DNA子鏈15-30個核苷酸構(gòu)成DNA或RNA單鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸1、DNA分子的3’端與5’端-OH端為3’;磷酸基團的末端為5’。2、DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈根據(jù)堿基互補配對原則形成氫鍵連接而成。DNA雙鏈反向平行3’5’5’基本單位ATGCATGC3’3’5’5’反應(yīng)周期高溫變性低溫復(fù)性適溫延伸反應(yīng)循環(huán)數(shù)：擴增倍數(shù)：106--10925--30DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）DNA分子的熱變性原理：變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物Ⅱ變性復(fù)性延伸三PCR的反應(yīng)過程5/3/G—GT—C5/3/G—GT—C5/3/G—A引物Ⅰ5/3/G—A引物Ⅰ5/3/G—G引物Ⅱ5/3/G—A引物Ⅰ3/

3/5/G—AC—C3/5/G—AC—C5/3/G—G引物Ⅱ5/3/G—G引物Ⅱ5/3/G—G引物Ⅱ3/5/3/G—A引物Ⅰ5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物Ⅱ（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性（2）PCR循環(huán)—復(fù)性55℃復(fù)性（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸4、循環(huán)特點：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物存于兩個子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長1×2N①②練習(xí)：見課課練P79第10題四、實驗步驟：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10分鐘將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進行反應(yīng)注意事項：詳見操作提示

五、結(jié)果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→測定→計算（公式見P63）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對照50倍PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯誤的一項是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR