大腸菌群三步法與兩步法的比較

關(guān)于大腸菌群三步法與兩步法的比較第1頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三試驗菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)稀釋、混勻待用設(shè)置空白對照與多個平行樣品制備檢驗過程樣品三步法兩步法乳糖發(fā)酵平板分離證實試驗初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵查MPN檢索樣品中的總大腸菌群MPN值，統(tǒng)計學(xué)方法計算試驗樣品按照不同模擬污染水平進(jìn)行人工添加第2頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作第3頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三樣品制備1.試驗樣品種類與數(shù)量選擇

為了模擬大腸菌群在不同樣品中生長環(huán)境不同，樣品組成不同，選用種類不同的樣品，如水、食物、化妝品等，食物樣品又可分為肉類、乳制品、水產(chǎn)品、淀粉類、蔬果類等，同時避免選擇添加了防腐劑的樣品。選擇合適的種類數(shù)與數(shù)量，處理前經(jīng)檢驗確定無大腸菌群與干擾菌或進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。2.空白試驗在分析工作中，存在著系統(tǒng)誤差，包括試劑及用水含有雜質(zhì)所造成的誤差等，為消除這部分影響，提高分析準(zhǔn)確度，所以要做空白試驗。第4頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三樣品制備3.菌株選擇將大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株（包括大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌）于培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h后混合。4.菌落計數(shù)用滅菌的磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液比生理鹽水（NS）合適。因為PBS在稀釋的同時可以保護(hù)菌體，調(diào)節(jié)pH值，而且市面上有成品出售；而NS只是純粹的稀釋液。)進(jìn)行十倍系列稀釋至10-10，用后4個稀釋度*用營養(yǎng)瓊脂計數(shù)。每種濃度吸取1mL加到融化溫度46℃的15mL左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻凝固，35攝氏度培養(yǎng)24h，取出進(jìn)行菌落計數(shù)。（*：趙貴明，邊凌淳，應(yīng)用不同方法檢測食品中大腸菌群結(jié)果的比較，微生物學(xué)雜志，2003年11月第23卷第6期）第5頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三樣品制備菌落計數(shù)流程圖

1.選擇平均菌落數(shù)在30~300之間者進(jìn)行計算，若只有一個稀釋度平均菌落數(shù)符合此范圍，則將該菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。2.若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則取較小數(shù)字。3.若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)均不在30~300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則報告未檢出。36±1℃48±2h做成幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇2~3個適當(dāng)稀釋度，各以1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)每皿加入適量的營養(yǎng)瓊脂菌落計數(shù)報告檢樣第6頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三樣品制備5.試驗樣品制備按照不同樣品類別分別按規(guī)定加入磷酸緩沖液處理，每份樣品分高、中、低三個水平進(jìn)行菌懸液人工添加，高度污染為添加600-1200CFU/g，中度污染添加120-600CFU/g，低度污染添加30-120CFU/g，以保證樣品含菌數(shù)量在檢測范圍內(nèi)。同時用相同樣品做三份平行試驗與一份空白試驗。均質(zhì)后，-18℃保存?zhèn)溆茫囼炃坝脽o菌磷酸緩沖液稀釋至10-3。第7頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三檢驗方法：三步法與兩步法三步法：水樣接種到雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上培養(yǎng)挑選可疑菌落染色、鏡檢、證實試驗乳糖發(fā)酵試驗分離培養(yǎng)證實試驗兩步法：接種月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯培養(yǎng)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中取培養(yǎng)物移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中培養(yǎng)初發(fā)酵試驗復(fù)發(fā)酵試驗第8頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三三步法所用培養(yǎng)基及其作用乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨………提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求牛肉膏………提供碳源乳糖…………大腸菌群可分解的糖類氯化鈉………可維持均衡的滲透壓溴甲酚紫乙醇溶液…………產(chǎn)酸指示劑蒸餾水………溶劑伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基蛋白胨………提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求乳糖…………大腸菌群可分解的糖類磷酸氫二鉀…中和過量酸瓊脂…………培養(yǎng)基固化劑蒸餾水………溶劑伊紅水溶液…大腸菌群特異性指示劑美藍(lán)水溶液…大腸菌群特異性指示劑

第9頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三兩步法所用培養(yǎng)基及其作用月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯胰蛋白胨或胰酪胨…提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求氯化鈉………………可維持均衡的滲透壓乳糖…………………大腸菌群可發(fā)酵的糖類磷酸氫二鉀（K2HPO4）……………緩沖劑磷酸二氫鉀（KH2PO4）……………緩沖劑月桂基硫酸鈉………抑制非大腸菌群細(xì)菌的生長蒸餾水………………溶劑 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 蛋白胨………………提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求乳糖…………………大腸菌群可發(fā)酵的糖類牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液…抑制非腸桿菌科細(xì)菌0.1%煌綠水溶液……抑制非腸桿菌科細(xì)菌 蒸餾水………………溶劑第10頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三兩步法所用培養(yǎng)基可否添加指示劑？對于LST而言：大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，如果用指示劑一般就是用酸堿指示劑，LST培養(yǎng)基里有月桂基硫酸鈉（SDS十二烷基硫酸鈉），它是陰離子表面活性劑，水溶液呈堿性，為了讓大腸菌群生長，培養(yǎng)基里就需要用磷酸緩沖液維持PH中性，所以加了酸堿指示劑也沒有什么用。對于BGLB而言：BGLB中的煌綠本身就是指示劑，在培養(yǎng)基中呈綠色，它的指示范圍是0.0（黃）—2.6（綠），一般培養(yǎng)過程中都是綠色，不具有典型性和代表性。但是也有少數(shù)情況培養(yǎng)出來酸產(chǎn)生的過多變成了黃色，所以加了指示劑可能會干擾現(xiàn)象觀察。加之大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有氣泡就能判斷，不用加指示劑。第11頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯這兩種培養(yǎng)基相對于乳糖膽鹽蛋白胨水有什么特別之處？

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）乳糖蛋白胨培養(yǎng)基成分（g/L）胰蛋白胨（20.0）氯化鈉（5.0）乳糖（5.0）磷酸二氫鈉（2.75）磷酸氫二鈉（2.75）月桂基硫酸鈉（0.1）蛋白胨（10.0）乳糖（10.0）0.1%煌綠水溶液（13.3mL）牛膽粉溶液（200mL）蛋白胨（10.0）乳糖（5.0）牛肉膏（3.0）溴甲酚紫乙醇溶液（16.0,1mL）氯化鈉（5.0）碳源/氮源乳糖/胰蛋白胨乳糖/蛋白胨乳糖、牛肉膏/蛋白胨抑制劑月桂基硫酸鈉（陰離子表面活性劑）煌綠、膽鹽無第12頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三LST、BGLB、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的區(qū)別1.氮源區(qū)別BGLB與乳糖蛋白胨培養(yǎng)基氮源為蛋白胨，LST培養(yǎng)基氮源為胰蛋白胨（蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑。）（胰蛋白胨，又稱胰酪蛋白胨、胰酶消化酪蛋白胨，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白胨，是以新鮮牛肉和牛骨經(jīng)胰酶消化，濃縮干燥而成的淺黃色粉末。）主要區(qū)別在于：胰蛋白胨處理后，很多大分子的蛋白分子量變小，這樣的話，細(xì)菌更容易利用。價格較蛋白胨貴。第13頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三LST、BGLB、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的區(qū)別2.培養(yǎng)基中的抑制劑區(qū)別LST培養(yǎng)基中為月桂基硫酸鈉（SDS），為陰離子表面活性劑，有表面活性作用，有利于提高革蘭陰性菌活性與分散菌體的作用，就有更好的分離效果。所以作為鑒別的培養(yǎng)基。BGLB中煌綠是一種抑菌劑，主要抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌。由于本培養(yǎng)基的抑菌作用非常強(qiáng)，所以可以排除一些假陽性的結(jié)果，常用作確證試驗。乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中沒有加入抑制劑，所以需要用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基做特異性鑒別。第14頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三三步法流程圖檢樣稀釋乳糖蛋白胨培養(yǎng)基36℃±1℃,24h±2h不產(chǎn)氣大腸菌群陰性產(chǎn)氣伊紅美蘭瓊脂平板報告36℃±1℃，18h-24h革蘭氏染色乳糖蛋白胨培養(yǎng)基革蘭氏陽性革蘭氏陰性無芽孢桿菌大腸菌群陰性報告大腸菌群陽性產(chǎn)酸產(chǎn)氣不產(chǎn)酸產(chǎn)氣報告36℃±1℃，24h±2h大腸菌群陰性報告第15頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中大腸菌群生長現(xiàn)象大腸菌群分解乳糖蛋白胨培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣。溴甲酚紫是pH指示劑，酸性呈黃色，堿性呈紫色。大腸菌群發(fā)酵后呈黃色，空白對照呈紫色。大腸菌群發(fā)酵后產(chǎn)氣，倒管內(nèi)有氣泡?？瞻讓φ談t無氣泡。第16頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上大腸菌群菌落現(xiàn)象當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時細(xì)菌帶正電荷被染成紅色，再與美藍(lán)結(jié)合形成紫黑色菌落，并帶有綠色金屬光澤。第17頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三檢樣：25g（或25ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇適宜三個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管36℃±1℃48h±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣BGLB肉湯36℃±1℃大腸菌群陰性大腸桿菌陽性不產(chǎn)氣產(chǎn)氣查MPN表報告結(jié)果兩步法流程圖48h±2h第18頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三大腸菌群在LST培養(yǎng)基中現(xiàn)象大腸菌群在LST培養(yǎng)基中產(chǎn)氣，倒管內(nèi)有氣泡。第19頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三大腸菌群在BGLB培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性結(jié)果倒管內(nèi)均有氣泡。若產(chǎn)酸過多，由于有指示劑煌綠存在（指示范圍pH0.0黃-2.6綠），則由綠色變?yōu)辄S色（右）。第20頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三結(jié)果計數(shù)前提：若空白對照無大腸菌群檢出，證明實驗無系統(tǒng)誤差干擾，結(jié)果準(zhǔn)確性可以保證。計算三步法與兩步法最終確證的大腸菌群陽性管數(shù)，檢索國標(biāo)中的MPN表，統(tǒng)計好每個樣品MPN數(shù)。根據(jù)樣品制備時加入的不同梯度（高、中、低）菌落形成單位與查詢MPN表，看實際添加菌落形成單位是否落在MPN表的95%置信區(qū)間內(nèi)。統(tǒng)計好兩個方法落在范圍外以及陰性管數(shù)與陽性管數(shù)。第21頁，講稿共24頁，2023年5月2日，星期三MPN表MPN(MostProbableNumber)

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