技術(shù)與質(zhì)譜儀的使用

關(guān)于技術(shù)與質(zhì)譜儀的使用第1頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三MALDI技術(shù)離子化技術(shù)：MALDIMatrix-AssistedLaserDesorption/IonizationMALDI技術(shù)的原理樣品與基質(zhì)，在樣品靶表面形成的共結(jié)晶薄膜激光照射，基質(zhì)吸收能量基質(zhì)把能量傳遞給樣品分子，將電荷轉(zhuǎn)移給樣品，樣品電離。第2頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三MALDI技術(shù)中基質(zhì)的作用基質(zhì)的作用把樣品分子彼此分開(kāi)(基質(zhì)：樣品=10，000：1)，削弱樣品分子之間的相互作用。基質(zhì)吸收激光的能量，并將部分能量傳遞給樣品。幫助樣品離子化。第3頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三常用基質(zhì)及選擇基質(zhì)樣品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，極性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，極性聚合物HPA核苷酸Dithranol非極性聚合物IAA非極性聚合物第4頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三LaserSampleTargetDetectorClockTime-of-FlightMolecularMassTOF的基本原理

第5頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三EnablingLifeScienceToolsBasedonMassSpectrometryTMEk

=zqUEk=1/2mV2V2=2qUz/m=2qU/(m/z)第6頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三triggerdiodelaservariableattenuator250l/sturbo250l/sturbo3.4mreflector1.8mlinearMALDITOFMS的構(gòu)成檢測(cè)器1：線性模式檢測(cè)器2：反射模式第7頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三反射模式下TOF的分辨率高于線性模式第8頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三線性模式和反射模式優(yōu)缺點(diǎn)所選方法（即flexcontrolmethods）反射模式（linear）一般測(cè)試分子量小于4000的樣品分辨率高，單同位素清晰準(zhǔn)確線性模式（reflection）一般測(cè)試大分子量樣品（M>4000）分辨率低，得到是平均分子量的質(zhì)荷比第9頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三樣品和標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)靶標(biāo)準(zhǔn)品的作用：對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)，使樣品測(cè)試的質(zhì)量準(zhǔn)確度更高。注意：樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，必須點(diǎn)靶方式一致，所選基質(zhì)一樣。第10頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法:樣品與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在同一靶點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：樣品和標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)條件一致，質(zhì)量準(zhǔn)確度更高，質(zhì)荷比可準(zhǔn)確到0.02。缺點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)品干擾樣品出峰。外標(biāo)法:樣品與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在不同靶點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品干擾缺點(diǎn)：質(zhì)量準(zhǔn)確度低，質(zhì)荷比準(zhǔn)確到0.1。第11頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三MALDI常用點(diǎn)靶方法干滴法（DriedDroplet）樣品和基質(zhì)充分混合，點(diǎn)樣樣品靶上。注意：以HCCA和DHB為基質(zhì)的樣品，一般用干滴法點(diǎn)靶薄層法先將基質(zhì)點(diǎn)于靶上，帶基質(zhì)結(jié)晶后，再把樣品溶液點(diǎn)于基質(zhì)的層上。注意：以HPA為基質(zhì)的樣品，都要采用薄層法。第12頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三點(diǎn)樣方法：DriedDropletmatrixanalytesamplesolutionsampledepositionAnalytedispersedthroughoutmatrixcrystalsEnablingLifeScienceToolsBasedonMassSpectrometryTM第13頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三MALDI-TOF質(zhì)譜儀的使用標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)靶；樣品點(diǎn)靶；進(jìn)樣品靶；質(zhì)譜測(cè)試和圖譜保存：flexcontrol軟件；圖譜讀取和分析：flexanalysis軟件第14頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三點(diǎn)靶注意事項(xiàng)移液槍的使用取不同試劑，需要更換一次性槍頭。點(diǎn)靶注意事項(xiàng)防止基質(zhì)污染，防止標(biāo)準(zhǔn)品污染，防止樣品靶污染，防止試劑污染防止樣品靶跌落點(diǎn)靶時(shí)，槍頭請(qǐng)勿接觸樣品靶（懸點(diǎn)）點(diǎn)完靶，請(qǐng)?jiān)诎斜硐鄳?yīng)位置標(biāo)明樣品名第15頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三進(jìn)靶和退靶點(diǎn)擊儀器右側(cè)面的綠色按鈕（loadandeject按鈕）。在flexControl軟件里，點(diǎn)擊carrier后面按鈕進(jìn)退靶按鈕第16頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三質(zhì)譜測(cè)試和圖譜保存質(zhì)譜測(cè)試的軟件是：flexcontrol打開(kāi)軟件選擇方法校準(zhǔn)儀器的參數(shù)（與ESI-MS（LCQ）差別）掃描樣品保存數(shù)據(jù)上傳數(shù)據(jù)至大型儀器管理平臺(tái)文件系統(tǒng)第17頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三打開(kāi)桌面Flexcontrol軟件雙擊打開(kāi)flexcontrol第18頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇方法選擇方法第19頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三方法的選擇根據(jù)分子量大小選擇相應(yīng)的方法方法路徑：D:\methods\flexcontrolmethods\usualmethod一般樣品正離子都能出峰；對(duì)于正離子模式不出峰的樣品，改換為負(fù)離子模式的方法掃描。更換方法時(shí)，對(duì)以前的方法不要保存。第20頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇方法L:線性模式R:反射模式P:正離子模式N:負(fù)離子模式PepMix:多肽混合物，適合范圍700-4000DaProtMix:蛋白混合物，適合范圍5000–20000DaClinProt:多肽/蛋白化合物，適合范圍1000–20000Da66kDa:大分子蛋白，適合范圍20000-100000DaProteomics_HPC:高精度校正，適合范圍700-4000DaRP_lowmolecular_HPC高精度校準(zhǔn)，適合范圍100-1000Da第21頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.反射模式；正離子；高精度；700-4000Da；與RP_PepMix.par差別不大1.反射模式；正離子；700-4000Da3.線性模式；正離子；700-4000Da4.反射模式；負(fù)離子；700-4000Da5.線性模式；正離子；5000-20000Da6.線性模式；負(fù)離子；700-4000Da7.反射模式；正離子；100-1000第22頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三Flexcontrol的按鈕檢測(cè)范圍，可微調(diào)掃描區(qū)放大表峰顯示單次掃描顯示疊加圖第23頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三保存數(shù)據(jù)的按鈕第24頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三校準(zhǔn)儀器的參數(shù)第25頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三掃描標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，出峰太弱，多疊加幾次。點(diǎn)擊Calibrate，選中疊加圖，點(diǎn)擊自動(dòng)校準(zhǔn)（automaticassign），點(diǎn)擊apply，即完成自動(dòng)校正。如果自動(dòng)校準(zhǔn)通過(guò)不了，進(jìn)行手動(dòng)校準(zhǔn)。注意：必須有三個(gè)以上的點(diǎn)匹配上，匹配點(diǎn)越多越好第26頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三手動(dòng)校準(zhǔn)第27頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三掃描樣品和保存數(shù)據(jù)找到樣品點(diǎn)的位置掃描樣品，疊加并保存數(shù)據(jù)

注意：數(shù)據(jù)要保存到課題文件夾內(nèi)，例如：劉育課題組數(shù)據(jù)保存到D:\data\Liuyu\2011\06第28頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三在flexAnalysis打開(kāi)保存的路徑樣品的名字保存的是疊加圖FlexAnalysis方法，可不選擇第29頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)的上傳找到所保存的數(shù)據(jù)文件右鍵點(diǎn)擊發(fā)送到壓縮文件夾（zipped）打開(kāi)大型儀器管理系統(tǒng)網(wǎng)站（）文件系統(tǒng)，上傳壓縮后的數(shù)據(jù)文件夾。第30頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三第31頁(yè)，講稿共34頁(yè)，2023年5月2日，星期三MALDI質(zhì)譜圖解析常見(jiàn)離子峰：正電荷模式：加質(zhì)子峰；加合堿金屬峰（加Na+峰；加K+峰）;減e-峰負(fù)電荷模式：加e-峰，加Cl-多出現(xiàn)單電荷分子離子峰，雙電荷和多電荷峰弱或幾乎不出現(xiàn)。第32頁(yè)，