色譜的定性與定量

關(guān)于色譜的定性與定量第1頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、色譜的定性分析1、利用保留值定性

鑒別每個色譜峰通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性 即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份第2頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（1）氣相色譜中用保留值定性的方法

①利用已知物直接對照進(jìn)行定性分析通常做法：把未知物和已知標(biāo)準(zhǔn)物在同一根色譜柱上，用相同的色譜操作條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖后利用保留時間進(jìn)行比對為避免載氣流速和溫度變化引起保留時間的變化，可用相對保留值定性或用已知物增加峰高法定性第3頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

已知物增加峰高法定性原理：在得到未知樣品的色譜圖后，往未知樣品中加入一定量的已知物質(zhì)，在同樣色譜條件下的兩色譜圖對比圖譜比較峰高。第4頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三②利用相對保留值定性

定義：相對保留值是組分i與基準(zhǔn)物S的調(diào)整保留值之比：

優(yōu)點：可以消除某些操作條件的影響，只要柱溫、固定相不變，即使柱徑、柱長、填充情況及流動相的流速有所變化，相對保留值γ仍然不變，它是色譜定性分析的重要參數(shù)第5頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三③利用保留指數(shù)定性

表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上所公認(rèn)的定性參數(shù)，它具有定性可靠，重現(xiàn)性好，標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一等優(yōu)點。

可將儲存在計算機中的標(biāo)準(zhǔn)保留指數(shù)轉(zhuǎn)換成用戶色譜條件下的保留指數(shù)和保留時間（tR）第6頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（A）定義（B）保留指數(shù)的測定保留指數(shù)的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好，用同一色譜柱測定誤差小于1%，因此只要柱溫和固定液相同，就可以用文獻(xiàn)上發(fā)表的保留指數(shù)定性。第7頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（2）液相色譜中用保留值定性的方法

保留值定性的主要方法

★直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對照★某一未知峰和已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值完全相同—可能是★改變色譜柱或流動相，保留時間仍完全相同—基本是第8頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三利用文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比和定性分析

注意HPLC的柱填充技術(shù)的復(fù)雜性，定性受到限制第9頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

最簡單的方法：標(biāo)準(zhǔn)添加法

前提：要有標(biāo)準(zhǔn)物

判斷的標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)樣后，使未知樣色譜峰增高，改變色譜條件，未知峰仍能增高第10頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三同時用其他方法其他色譜方法（改變機理，如：用不同的色譜柱）其他檢測器PDA，光譜圖比較、譜庫檢索確認(rèn)色譜峰的純度

-保證每個色譜峰下只有一個被測的組份

-檢查是否有共流出的物質(zhì)（雜質(zhì)）干擾色譜峰純度確認(rèn)的方法

-用光電二極管矩陣檢測器比較光譜圖

-峰純度鑒定，四波長比例MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索其他儀器方法第11頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（3）平面色譜中用保留值定性的方法

定性方法：比較未知組分和已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比移值影響比移值的因素：固定相的性質(zhì)、展開劑的性質(zhì)、被分離組分的性質(zhì)、展開時的溫度等注意事項①展開槽應(yīng)密閉②沿分離軌跡固定相與流動相無梯度變化③展開劑的前沿位置能正確測定第12頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2.聯(lián)機定性

聯(lián)機定性是指把色譜和質(zhì)譜、紅外、紫外和核磁共振法聯(lián)合使用聯(lián)用方式：第一種：先收集色譜分離后的組分，再用“四大譜”的方法進(jìn)行定性分析第二種：通過“接口”技術(shù)直接把色譜和“四大譜”儀器連接起來，對每一被分離的組分進(jìn)行定性分析第13頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、色譜定量分析定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測定檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法第14頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（一）定量分析基礎(chǔ)1.定量分析的基本公式定量分析的目的：

要確定樣品中某一組分的準(zhǔn)確含量，是一種相對的定量方法

定量分析的方法：

在某些限定條件下，檢測器響應(yīng)值（色譜峰的峰面積或峰高）---所測組分的數(shù)量或濃度成正比，第15頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三即：

式中：–組分i的質(zhì)量

—組分i的濃度

—組分的校正因子（與檢測器的性質(zhì)和被測組分的性質(zhì)有關(guān)）

—組分i的峰面積，

—組分i的峰高第16頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2.峰面積的準(zhǔn)確測定1）對稱峰的峰高和峰面積的測定第一法：峰高×半高峰寬式中：h—從峰頂?shù)椒宓拙€的垂直距離

Wh/2—峰高1/2處的峰寬第17頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第二法：三角形法式中：BM—三角形的高

Wi—三角形KML的半高寬，近似等于色譜峰高0.607處的峰寬第18頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2)不對稱峰峰高和峰面積的測量第一法：峰高×峰寬的平均值式中：h—峰頂?shù)椒宓拙€的垂直距離

?（b0.15+b0.85)—峰高0.15處和峰高0.85處的峰寬平均值第19頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第二法：峰分割計算后加和法

A=A1+A2=h1×b1+h2×b2第三法：大峰上的小峰峰面積的測量第四法：基線漂移時色譜峰峰面積的測量第五法：重疊峰峰面積的測量第20頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三3.定量校正因子的測定（1）絕對校正因子（fi)★fi的物理意義:單位峰面積所代表的I組分的量,是一個與i組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測器的性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)★定量校正因子的計算公式為：注意:峰高定量校正因子fi(h)受操作條件影響較大

第21頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

絕對校正因子fi的大小主要由操作條件和儀器的靈敏度所決定，既不容易準(zhǔn)確測量，也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)操作條件波動時，fi也發(fā)生變化。故fi無法直接應(yīng)用，定量分析時，一般采用相對校正因子。第22頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（2）相對校正因子（校正因子）：式中：f--相對校正因子，簡稱為校正因子，無因次量

fi,fs—i物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)（s）的質(zhì)量（或濃度)Ai(hi),As(hs)---物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積（或峰高）第23頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

根據(jù)物質(zhì)量的不同表示方法，校正因子分為：①質(zhì)量校正因子(fm)

定義：當(dāng)物質(zhì)量用質(zhì)量來表示時的校正因子稱為質(zhì)量校正因子(fm),表示單位峰面積所代表的組分質(zhì)量，質(zhì)量一般用g或mg表示.

式中：mi,ms-被測物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量

Ai,As-被測物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積

第24頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三②摩爾校正因子(fM)

定義：物質(zhì)的量用摩爾數(shù)表示，表示單位峰面積所代表的組分摩爾數(shù)

式中：Mi,Ms-被測物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量第25頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三③體積校正因子（fv）定義：物質(zhì)的量用體積表示,表示單位峰面積所代表的組分體積。

式中：Vi,Vs—表示被測物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的體積第26頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三(3)相對響應(yīng)值sˊ

相對響應(yīng)值是物質(zhì)i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)S的響應(yīng)值（靈敏度）之比。單位相同時，與校正因子互為倒數(shù)，即：與只與試樣、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及檢測器類型有關(guān)，而與操作條件和柱溫、載氣流速、固定液性質(zhì)等無關(guān)，是一個能通用的常數(shù)。

第27頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（4）校正因子的實驗測量方法

★樣品的準(zhǔn)備：測定校正因子時，要精密稱定適量色譜純的被測組分和基準(zhǔn)物質(zhì)，配制成已知準(zhǔn)確濃度的樣品。★樣品的測定：在已確定的色譜條件下，取準(zhǔn)確體積的樣品進(jìn)樣，從譜圖上獲得準(zhǔn)確的峰面積

★計算：根據(jù)相對校正因子的計算公式可以算出質(zhì)量（或摩爾或體積）校正因子第28頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例：某試樣合有5μg乙醇，測得相應(yīng)的色譜峰面積為150mm2，求乙醇的fi。解：即每平方毫米色譜峰面積代表3.3×10-2μg乙醇第29頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的色譜純對二甲苯、甲苯、苯及仲丁醇，混合后稀釋，采用氫焰檢測器，定量進(jìn)樣并測量各物質(zhì)所對應(yīng)的峰面積，數(shù)據(jù)如下：物質(zhì)苯仲丁醇甲苯對二甲苯

m/μg0.47200.63250.81490.4547A/cm22.603.404.102.20以仲丁醇為標(biāo)準(zhǔn)，計算各物質(zhì)的相對質(zhì)量校正因子。第30頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第31頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（二）定量方法1.歸一化法

★定義：把所有出峰的組分含量之和按100%計的定量方法稱為歸一化法，是一種相對定量方法?！锴疤幔簶悠分械乃薪M分都能流出色譜柱，而且在檢測器上所有的組分都能產(chǎn)生信號。計算方法：

第32頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三★優(yōu)點：歸一化法很直觀，容易接受，計算簡便、準(zhǔn)確，當(dāng)操作條件如進(jìn)樣量、流速等發(fā)生變化時，對計算結(jié)果的影響很小，是一種常用的計算方法★缺點：校正因子的測定比較麻煩，必需所有組分都出峰★注意：▼主要用于GC的定量測定，當(dāng)fi相近時，可直接用峰面積歸一化法。▼由于檢測技術(shù)的影響,HPLC中很少使用歸一化

第33頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2、內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法：選擇適宜的物質(zhì)作為待測組分的參比物，定量加到樣品中去，根據(jù)待測組分和參比物在檢測器上的響應(yīng)值之比和參比物加入量進(jìn)行定量分析的方法。第34頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)物的選擇原則：A、內(nèi)標(biāo)物必須是原樣品中不存在的物質(zhì)，其性質(zhì)盡量與待測組分相近(同系物、異構(gòu)體)B、內(nèi)標(biāo)物不能和被測組分起化學(xué)反應(yīng)，要能完全溶于被測樣品中；C、內(nèi)標(biāo)物的峰盡可能接近待測組分的峰，或位于幾個待測組分的中間，但必須和樣品中的所有峰完全分離；D、內(nèi)標(biāo)物的加入量應(yīng)和待測組分相近。第35頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

待測組分(i)的量mi為：設(shè)樣品的總量為m，則待測組分i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為第36頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三內(nèi)標(biāo)法的特點：★無歸一化法的限制，即只要被測組分能出峰，不和其他峰重疊，不管其他組分是否出峰或是否重疊，都可以用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析★定量準(zhǔn)確，受操作條件影響較小

★可部分補償待測組分在樣品前處理時的損失★若加入幾種內(nèi)標(biāo)物，還可提高定量分析的精度★內(nèi)標(biāo)物的選擇比較困難，同時內(nèi)標(biāo)物稱量要求準(zhǔn)確，操作麻煩第37頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法

如果每次稱取同樣量(m)的試樣，每次加入相等量(ms)的內(nèi)標(biāo)物，則上式中m，ms，fi’均為常數(shù)，計算公式可寫為：從內(nèi)標(biāo)公式可知第38頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三實際色譜圖第40頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例:取二甲苯生產(chǎn)母液1500mg，母液中合有乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯及溶劑和少量苯甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以150mg壬烷作內(nèi)標(biāo)物，測得有關(guān)數(shù)據(jù)如下：物質(zhì)壬烷乙苯對二甲苯間二甲苯鄰二甲苯Ai/cm298709512080f`m1.020.971.000.960.98求:各組分的含量。第41頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用內(nèi)標(biāo)法計算。由各組分的絕對校正因子計算得壬烷、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的相對校正因子分別為1.00，0.95，0.98，0.94，0.96。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算公式，對于乙苯有：同樣可以計算出對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.5%，11.5%，7.84%。第42頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三3、外標(biāo)法

外標(biāo)法又可分為標(biāo)準(zhǔn)曲線法和外標(biāo)一點法，是色譜定量分析中比較常用的一種方法，是絕對定量方法。第43頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三計算方法：用濃度～峰面積（峰高）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其斜率即為絕對校正因子，應(yīng)該是一條通過原點的直線。

第44頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三特點：★簡便、快速、適合于大量樣品的分析★無需各組份都被檢出、洗脫★需要標(biāo)樣★標(biāo)樣及樣品測定的條件要一致★進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確，重復(fù)性好★對樣品前處理過程中待測組分的變化無法補償。第45頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三外標(biāo)一點法

利用待測組分純物質(zhì)配制一個與待測組分含量相近的標(biāo)準(zhǔn)樣（設(shè)量為ms），在同一色譜條件下，分別將相同量的待測組分標(biāo)樣及試樣注入色譜儀，出峰后，測量其峰面積（或峰高），得相應(yīng)的峰面積As和Ai

第46頁，講稿共51