瘧原蟲血片制作染色課件

2023/7/101瘧原蟲血片制作及染色技術(shù)胡樂群湖北省疾病預(yù)防控制中心血片制作所需設(shè)備載玻片具有磨砂面，且規(guī)格是玻片寬度乘長(zhǎng)度在25.2*75.2mm，厚度1mm~1.2mm為好。推玻片有專用的。但現(xiàn)在一般選擇邊緣光滑整齊的載玻片替代推玻片。采血針使用一次性的采血針。玻片盒木制/塑料均可以。75%酒精棉球用于采血部位的消毒。記號(hào)筆/B2鉛筆用于載玻片上編寫號(hào)碼。Whatman(沃特曼)903號(hào)；將濾紙切成10*2cm大小的紙片，以口徑為1.2cm的大孔管，在濾紙上壓出兩個(gè)圓形印跡備用。2023/7/103載玻片的清洗

載玻片用以涂制血膜的載玻片，必須清潔無(wú)油跡。有油跡的載玻片涂制的厚血膜容易脫落，薄血膜涂不均勻。新玻片處理應(yīng)浸于有液態(tài)洗滌劑清水中10~20分鐘，然后用干凈棉巾逐個(gè)擦拭，再用清水沖洗干凈，晾干后用干凈柔軟的棉巾擦亮備用。也可以95%的乙醇浸泡5~10分鐘，再用紗布擦干擦亮備用。舊玻片處理用過(guò)的玻片浸泡洗滌劑溶液中1~2天或者浸泡于煮沸好的5%肥皂水中1~2小時(shí)，逐個(gè)擦去玻片上的舊血膜痕跡，用清水漂洗干凈擦干擦亮。洗凈載玻片處理每10~20張用白紙包好或者裝原玻片盒里再放入塑料袋內(nèi)，保存于干燥環(huán)境中備用。2023/7/104取血部位及方法取血部位及方法

取血部位以耳垂較為合適，也可在手指末端采血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血針迅速刺入取血部位1~2毫米深，然后用左手大拇指、食指和右手中指協(xié)同擠出血滴。2023/7/105采血時(shí)間取血時(shí)機(jī)現(xiàn)癥病人一般可隨時(shí)取血，瘧疾普查時(shí)可不考慮取血時(shí)機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時(shí)，則應(yīng)掌握適宜的取血時(shí)機(jī)。間日瘧在寒熱發(fā)作時(shí)，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時(shí)，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷瘧疾的有利時(shí)機(jī)；36~48小時(shí)，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時(shí)間是在發(fā)作后至20小時(shí)內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到瘧原蟲。2023/7/107厚血膜血量及涂片法厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4~5微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過(guò)厚易于脫落，過(guò)薄達(dá)不到檢出率的要求。2023/7/108薄血膜血量及涂片法薄血膜取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點(diǎn)從取血部分刮取約1~1.5微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，并形成25~35度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米寬度時(shí)，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長(zhǎng)）且邊緣帶有“舌狀”的薄血膜。2023/7/1010血片編號(hào)血膜制成后，立即將受檢者的個(gè)人編號(hào)寫在玻片磨砂面上（血片的編號(hào)要與血檢登記本上編號(hào)一致）以防差錯(cuò)。2023/7/1011制作血膜的注意事項(xiàng)

1.

玻片清洗時(shí)，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無(wú)油漬或污垢。制片時(shí)，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。2023/7/1012制作血膜的注意事項(xiàng)2.剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)或者實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上。厚血膜未干前勿使標(biāo)本片傾斜，以免未干的血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不易溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時(shí)應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應(yīng)及時(shí)裝入標(biāo)本盒內(nèi)。新木制標(biāo)本盒需敞開放置一段時(shí)間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜血紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染液種類：目前所用的血片染色液，雖然名稱很多，但都是從羅門諾夫斯基氏創(chuàng)造的染液變化過(guò)來(lái)的?？偟目煞譃樗芤汉途凭芤簝纱箢?，前者包括羅氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被國(guó)家推薦使用）等。這些染液中的主要染劑都包含美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青，所以稱為多色性染劑。2023/7/1015血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染色原理：伊紅是酸性水溶性鈉鹽，美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當(dāng)它們各自溶化水中時(shí)，就離解為帶陽(yáng)電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽(yáng)離子，在遇到堿性的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等即可結(jié)合成不易溶于水的沉淀物染成紅色。美蘭主要離解為堿性的美蘭離子，美蘭就與瘧原蟲、淋巴和大單核細(xì)胞的胞漿、嗜堿性白細(xì)胞的顆粒等酸性蛋白質(zhì)結(jié)合染成蘭色。2023/7/1017血片的染色

（一）染液的種類及染色原理注意：蛋白質(zhì)是二性電解質(zhì)，當(dāng)其處于較等電點(diǎn)為酸的溶液中時(shí)，便呈堿的作用，即與酸或陰離子結(jié)合，這就說(shuō)明為何在染液偏酸時(shí)，伊紅的著色力強(qiáng)，使紅細(xì)胞著色鮮艷而淋巴細(xì)胞和原蟲的胞漿著色不顯著；反之，蛋白質(zhì)在偏堿的溶液中呈酸的作用而中和堿基，也就說(shuō)明為何染液偏堿時(shí)，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫蘭色。

伊紅在水溶液內(nèi)遇到美蘭或天青，即可互相化合而產(chǎn)生沉淀從而失去染色力，因此，吉氏染液的母液絕對(duì)不能進(jìn)水。2023/7/1018血片的染色

（二）吉氏染液母液配置方法取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油染液混入瓶?jī)?nèi)，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55~60℃水浴中或溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)3~5天，多加搖動(dòng)，即成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。材料：1、吉氏粉0.5克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升2023/7/1019血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法血膜干燥后，用甲醇或無(wú)水酒精固定薄血膜，用過(guò)濾清水或自來(lái)水對(duì)厚血膜溶血，然后再進(jìn)行染色。

成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時(shí)對(duì)厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得酌情增減染色時(shí)間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。2023/7/1020血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法單張血片染色：薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用2%吉氏染液稀釋液1~2毫升，滴入血片標(biāo)本上染色30分鐘左右，或用中性蒸餾水1~2毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本上，染色20~30分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。2023/7/1021影響染色效果的因素血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個(gè)因素的影響：（1）染料溶劑的質(zhì)量染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時(shí)所用的器具必須干凈而無(wú)水份。2023/7/1022影響染色效果的因素（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現(xiàn)偏堿性。染液存放時(shí)間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。2023/7/1024影響染色效果的因素（4）染液的稀釋濃度染液的濃度高其著色就快而深，從而瘧原蟲寄生紅細(xì)胞的薛氏點(diǎn)粗大顯著，但顏色常偏堿；染液濃度過(guò)低則染色時(shí)間久，顏色偏酸，薛氏點(diǎn)不明顯或消失。2023/7/1025影響染色效果的因素（5）染色時(shí)間染色時(shí)間長(zhǎng)染色效果好，反之較差。室溫高則著色快，染色時(shí)間可略縮短，氣溫低可適當(dāng)延長(zhǎng)。因此染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當(dāng)增減。2023/7/1027影響染色效果的因素（7）染色后不要直接將染液殘?jiān)沟?，?yīng)沿玻片或染色缸邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污染片血膜。注：用于薄血膜的染色和一般漂洗時(shí)，用蒸餾水稀釋至1000ml，用于厚血膜及同一張玻片上厚血膜與薄血膜的染色時(shí)，用蒸餾水稀釋至500ml。

溶液Ⅰ溶液ⅡpHml磷酸氫二鈉含量(g)ml磷酸二氫鉀含量(g)6.654.70.52148.81.356.868.40.65126.81.15789.50.8599.20.97.196.80.9288.20.87.2105177.20.77.4126.31.255.10.5配制pH6.6~7.4緩沖液兩種貯備液用量表2023/7/1029血片制作和染色質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目檢查內(nèi)容質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好中差血片制作厚血膜血量4～5цl略多或略少過(guò)多或過(guò)少位置玻片右1/3稍偏右偏右過(guò)多直徑0.8～1.0cm0.7～0.8或1.0～1.2cm<0.7或>1.2cm外觀圓形厚膜均勻，邊緣整齊圓形稍不均不整齊厚薄不勻影響著色薄血膜血量1～1.5цl略多或略少過(guò)多或過(guò)少位置玻片1/2～1/3處稍偏右或偏左偏右或偏左過(guò)多直徑2.0～2.5cm稍大或稍小過(guò)多或過(guò)少外觀舌狀厚薄均勻，無(wú)劃痕舌狀稍不均厚薄不勻呈波浪型，有劃痕血片染色質(zhì)量外觀厚血膜完整厚血膜半脫落厚血膜全脫落涂片規(guī)則涂片順序，先厚后??；位置分配，血片自左向右：薄-厚-標(biāo)簽；推薄片用玻片短邊。錯(cuò)1項(xiàng)扣3分2023/7/1030瘧原蟲計(jì)數(shù)法（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)報(bào)告單）

★全血膜發(fā)現(xiàn)同種、同期瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以內(nèi)均記實(shí)際