檸檬酸的發(fā)酵

檸檬酸的發(fā)酵第1頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第一部分檸檬酸簡介檸檬酸又名枸櫞酸，學名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。化學名稱2-羥基丙三羧酸，英文文獻俗名citricacid，分子式C6H8O7。無色或白色晶體，無臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應。第2頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月一、用途1.檸檬酸主要應用于食品工業(yè),作為調(diào)味料,酸化劑或防腐劑,約占總產(chǎn)量的60%;2.用于醫(yī)藥工業(yè)作為許多藥品的合成原料、補血劑、輸血劑、酸化劑、防腐劑等約占總產(chǎn)量的12%;3.用于化學工業(yè)是許多化學產(chǎn)品的合成原料,如檸檬酸的醋類,包括檸檬酸三丁醋、三辛醋等等,都是無毒增塑劑用來制造食品包裝物、玩具等。檸檬酸鹽類,如檸檬酸鈉用作洗滌劑的助劑,以代替造成公害的三聚磷酸鈉。用于冶銅廢氣脫硫以回收硫磺免除公害。用于清洗鍋爐及各種熱交換器等。檸檬酸錢鹽除了作防腐劑外還應用于染料工業(yè),約占總產(chǎn)量的20%,如檸檬酸的醋類,包括檸檬酸三丁醋、檸檬酸三乙醋、三辛醋等等。4.其他方面如在混凝土中加人適量的檸檬酸可作緩凝劑在電鍍工業(yè)中可代替山萘（氰化鉀）實行無毒電鍍。在皮革工業(yè)中用于脫灰印染、油墨、曬圖、化妝品等都需要它。約占總產(chǎn)量的8%.第3頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月檸檬酸在食品中的應用

1)

飲料與冰淇淋檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲料以及軟飲料檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦于飲料水果風味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)，形成適宜的口味和風味；添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化穩(wěn)定性，防止氧化作用。第4頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2)

果醬與釀造酒檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進風味，并使產(chǎn)品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝膠性質(zhì)需要一定范圍的pH值，添加一定量的檸檬酸可以滿足這一要求。當葡萄或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足時，可以用檸檬酸調(diào)節(jié)，以防止所釀造的酒口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧化和保護色素的作用，以保護果汁的新鮮感和防止變色。第5頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月3)

腌制品

各種肉類和蔬菜在腌制加工時，加入或涂上檸檬酸可以改善風味，除腥去臭，抗氧化。4)

罐頭食品

加入檸檬酸除了調(diào)酸作用之外，還有螯合金屬離子的作用，保護其中的抗壞血酸，使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植物油中也有類似的作用。第6頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月5)

豆制品及調(diào)味品

用含有檸檬酸的水浸漬大豆，可以脫腥并便于后續(xù)加工。檸檬酸可以用于大豆等豆類蛋白、葵花子蛋白的水解，生產(chǎn)出風味別致的調(diào)味品。它也可以用于成熟調(diào)味品（醬油等）的調(diào)味。6)

其它

檸檬酸在醫(yī)藥、化學等其它工業(yè)中也有一定的作用。檸檬酸鐵胺可以用作補血劑；檸檬酸鈉可用作輸血劑；檸檬酸可制造食品包裝用薄膜及無公害洗滌劑。第7頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月二、市場需求全球檸檬酸的年需求量約為130萬噸左右，且以年5%-7%的速度遞增。2007年，全球檸檬酸需求繼續(xù)以3%的幅度增長。隨著中國人民生活水平的提高，也帶動了檸檬酸國內(nèi)需求的大幅度增加。我國檸檬酸主要消費于食品和飲料市場，其他消費領域包括醫(yī)藥、化妝品原料、洗滌劑原料以及工業(yè)領域，其中食品和飲料占70%左右，其他領域約30%。我國檸檬酸國內(nèi)需求量增長不大，國內(nèi)產(chǎn)量主要出口到國際市場。第8頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月目前，生產(chǎn)廠家近百家，萬噸級以上的有6家。主要有安徽豐原生物化學集團公司（生產(chǎn)能力為12.0萬噸/年）、江蘇無錫羅氏中亞檸檬酸有限公司（生產(chǎn)能力為4.0萬噸/年）、安徽華源生物藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)能力為3.5萬噸/年）等。存在問題：出口量增長過快，技術創(chuàng)新相對滯后，加上國際市場競爭激烈，已出現(xiàn)嚴重的供大于求的局面，設備利用率不到60%，行業(yè)經(jīng)濟效益呈滑坡態(tài)勢。第9頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月三、生產(chǎn)方法提?。褐参镌现刑崛?；發(fā)酵法：進行檸檬酸發(fā)酵制得。第11頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月四、發(fā)酵生產(chǎn)原料碳源：各種含淀粉的原料。國外生產(chǎn)檸檬酸主要碳源為糖蜜，糖蜜原料成分復雜、多變，使用前須進行處理，如加活性炭、黃血鹽、石灰、磷酸鈣等。我國以甘薯干粉用得最多，發(fā)酵使用濃度由原先的12％~16％提高至17％~22％，相應的產(chǎn)酸水平也由原來的6％~9％提高到10％~14％。為了解決高濃度的薯干粉給發(fā)酵及后處理帶來的麻煩，用純淀粉替代薯干粉或加適量的α淀粉酶進行液化是十分必要的。利用C9~C23的烷烴為原料時，需選擇合適的菌株并要解決溶解性問題。氮源：薯干粉不需要氮源。以淀粉等不含氮源時需加入適量氮源為0.3％~0.4％。微量元素：Cu、Mn、Mg等為所需的微量元素，但過量則將造成毒害。第12頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月五、生產(chǎn)菌種工業(yè)生產(chǎn)幾乎都是用黑曲霉作為生產(chǎn)菌大多數(shù)微生物在代謝過程中都能合成檸檬酸，正常生理狀況下很少積累檸檬酸。黑曲霉產(chǎn)酸量高，轉(zhuǎn)化率也高。且能利用多種碳源，因而是檸檬酸生產(chǎn)的最好菌種。用石油副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)檸檬酸，主要以假絲酵母屬為生產(chǎn)菌種，其次是畢赤酵母、球擬酵母、漢遜氏酵母和紅酵母屬的一些種。第13頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月1940年，Krebs:TCA；

1953年，Jagnnathan證實黑曲霉中存在EMP途徑所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖80%經(jīng)EMP途徑代謝；

1954-1955年，Ramakrishman等發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在TCA循環(huán)。一、檸檬酸合成途徑的發(fā)現(xiàn)第二部分檸檬酸合成途徑與代謝調(diào)控第14頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑第15頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月

黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定化反應生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。(1)生長期與產(chǎn)酸期都存在EMP與HMP途徑，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在TCA循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在以糖質(zhì)原料發(fā)酵時，當檸檬酸積累時，TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱。(3)由于TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由兩個CO2固定化反應體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸為主。第16頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月三、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機制第17頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月1、磷酸果糖激酶（PFK）：Mn2+濃度對磷酸果糖激酶的影響（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)

當培養(yǎng)基中Mn2+

缺乏時，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會升高。第18頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脫氫酶：催化生成乙酰CoA第19頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)1、檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)：檸檬酸合成酶是TCA循環(huán)第一個酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒有調(diào)節(jié)作用。2、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)：

順烏頭酸水合酶、NAD和NADP-異檸檬酸脫氫酶在檸檬酸產(chǎn)生與不產(chǎn)生時，這3種酶均存在，而當銅離子0.3mg/L，鐵離子2mg/L和pH2.0情況下，這3種酶均不出現(xiàn)活力，發(fā)酵中檸檬酸正是在這個pH條件下積累的。

順烏頭酸水合酶是催化檸檬酸<>順烏頭酸<>異檸檬酸正逆反應的酶，研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時能建立下面的平衡：檸檬酸:順烏頭酸:異檸檬酸＝90:3:7。第20頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)

在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中，TCA循環(huán)的一個顯著特點是，α-酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻遏。因此當以葡萄糖為碳源時，在檸檬酸生成期，菌體內(nèi)不存在α-酮戊二酸脫氫酶或活力很低。α-酮戊二酸脫氫酶催化的反應是TCA循環(huán)中唯一不可逆反應，一旦α-酮戊二酸脫氫酶喪失，就會引起：①TCA循環(huán)中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循環(huán)生成，使TCA循環(huán)成“馬蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。第21頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)氧對檸檬酸積累的調(diào)節(jié)

乙酰CoA和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過程中要引進一個氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對檸檬酸發(fā)酵的作用為：(1)氧是發(fā)酵過程生成的NADH2重新氧化的氫受體。(2)近來的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有一條標準呼吸鏈以外，還有一條側(cè)系呼吸鏈。

當缺氧時，只要很短時間中斷供氧，就會導致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。

第22頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月3醋酸

1檸檬酸生成的檸檬酸一半轉(zhuǎn)化為異檸檬酸酵母N源耗盡后開始烷烴發(fā)酵，低濃度AMP抑制NAD-異檸檬酸脫氫酶的活性，檸檬酸大量合成并積累。此時順烏頭酸水合酶催化反應平衡為：檸檬酸：異檸檬酸：順烏頭酸=90：7：3。細胞質(zhì)中積累大量異檸檬酸。乙醇乙酸（四）乙醛酸循環(huán)與醋酸發(fā)酵檸檬酸第23頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率1、無CO2固定反應的產(chǎn)率合成1分子檸檬酸需要3分子乙酰輔酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。理論產(chǎn)率為：192/(180×1.5)=

71.1%第24頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2、通過CO2固定反應提供C4二羧酸第25頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月一、檸檬酸發(fā)酵用原料檸檬酸發(fā)酵的原料有三大類糖質(zhì)原料(甘蔗廢糖蜜、甜菜廢糖蜜)、淀粉質(zhì)原料(主要是番薯、馬鈴薯、木薯等)正烷烴類原料。

第三部分檸檬酸生產(chǎn)第26頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月二、檸檬酸種子擴培

1)

試管斜面菌種培養(yǎng)察氏瓊脂培養(yǎng)基：NaNO3

3g，

蔗糖20g，

K2HPO4

1g，

KCl

0.5g，

MgSO4.7

H2O

0.5g，

FeSO4

0.01g，

瓊脂20g，

用水定溶至1000ml，

pH自然。

察氏-多氏瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖30g，NaNO3

2g，

MgSO4.7H2O

0.5g，

KH2PO4

1g，

KCl

0.5g，

FeSO4.7H2O

0.01g，

溴甲分綠0.4g，瓊脂20g，

蒸餾水1000ml，

pH自然。第27頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月1)

試管斜面菌種培養(yǎng)

蔗糖合成瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖140g，

NH4NO3

2g，

KH2PO4

2g，

MgSO4.7H2O

0.25g，

FeCl3.6H2O

0.02g，

MnSO4.4H2O

0.02g，

麥芽汁20ml，

瓊脂20g，

用水定溶至1000ml。

米曲汁瓊脂培養(yǎng)基：一份米曲加四倍質(zhì)量的水，于55℃保溫糖化3~4小時后煮沸，濾液用水調(diào)整濃度至10‘Bx，并用堿液將pH調(diào)制到6.0，接著添加瓊脂2%。確認所制成的斜面無雜菌污染后，接入黑曲霉孢子懸液0.1ml，于32℃培養(yǎng)4~5d。第28頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2)

種子擴大培養(yǎng)

①

二級擴大培養(yǎng)a

培養(yǎng)基

有瓊脂固體培養(yǎng)和液體表面培養(yǎng)兩種方法，前者的培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基相同，后者的組成如下：麥芽汁7?BX，氯化銨2%，尿素0.1%，

第29頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2)

種子擴大培養(yǎng)

①

二級擴大培養(yǎng)b

培養(yǎng)

固體培養(yǎng)時，500ml茄子瓶裝80ml瓊脂培養(yǎng)基，250ml茄子瓶裝50ml瓊脂培養(yǎng)基。滅菌后擺成斜面，凝固后的斜面至37℃下培養(yǎng)24h。確認無雜菌污染即可使用。

液體培養(yǎng)時，將液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，使液層深度達45cm，于0.1MPa下濕熱滅菌15min。按無菌操作接種。培養(yǎng)溫度32℃。液體表面需7~10d，瓊脂固體培養(yǎng)需6~7d。第30頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月②

三級擴大培養(yǎng)可采用麩曲固體培養(yǎng)、液體表面培養(yǎng)或瓊脂固體培養(yǎng)。

所用培養(yǎng)基如下：a

麩曲培養(yǎng)基：

新鮮小麥麩皮1kg，加水1.1~1.3L。液體培養(yǎng)基與第二級擴大培養(yǎng)基所用液體培養(yǎng)基相同。b瓊脂固體培養(yǎng)基：

與斜面培養(yǎng)基相同。第31頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月三、檸檬酸發(fā)酵工藝檸檬酸發(fā)酵是典型的好氧發(fā)酵，工業(yè)上好氧發(fā)酵基本上有三種，即表面發(fā)酵、固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵，前兩者是利用氣相中的氧，后者主要是利用溶解氧，這三種發(fā)酵方法各有優(yōu)缺點，都有經(jīng)濟上的可行性，工業(yè)上仍然有保留。第32頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代工業(yè)化大生產(chǎn)主要采用深層通風發(fā)酵法。日本約1／5的檸檬酸產(chǎn)品是利用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的，淺盤發(fā)酵法在前蘇聯(lián)、印度、捷克．波蘭、保加利亞、阿根廷等國家主要使用，我國、美國及西歐共同體國家則主要采用液體深層發(fā)酵法進行生產(chǎn)第33頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月一）表面發(fā)酵工藝表面發(fā)酵是利用生長在液體培養(yǎng)基表面的微生物代謝作用，將可發(fā)酵性原料轉(zhuǎn)化為檸檬酸，這種工藝出現(xiàn)最早，1923年由美國Chas.Pfizer公司實現(xiàn)了工業(yè)化，但主要是利用蜜糖原料來進行發(fā)酵的，采用表面發(fā)酵工藝具有一些優(yōu)點：（1）設備簡單，投資少，投產(chǎn)快；（2）操作技術簡單，能耗低；（3）原料粗放，而且適于高濃度發(fā)酵，產(chǎn)酸濃度也較高；但表面發(fā)酵存在的問題是設備占地面積大，勞動強度大，發(fā)酵時間長，菌體生長量多，而影響產(chǎn)率等。第34頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月這種培養(yǎng)方法菌的生長速度與培養(yǎng)基深度有關，單位體積的表面積越大，生長速度也越快。氧的供給常成為發(fā)酵的限速因素，所以發(fā)酵周期長，占地面積大。優(yōu)點是不需要深層培養(yǎng)時的攪拌和通氣，節(jié)省動力。如醋酸、檸檬酸發(fā)酵和曲盤制曲。第35頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月一）檸檬酸表面發(fā)酵工藝1表面發(fā)酵微生物工業(yè)上應用的菌種均為黑曲霉，在國外普遍采用孢子接種的方法進行表面發(fā)酵2干孢子的制備表面發(fā)酵用的種子，接種量大，最初采用大批量的茄子瓶培養(yǎng)，使用前在無菌條件下制成孢子懸液，接入發(fā)酵液中，然后分裝接入發(fā)酵盤，這種方法工作量大，而且種子質(zhì)量不能保證，不適宜大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)應用，采用干孢子接種是淺盤發(fā)酵工藝能實現(xiàn)工業(yè)化的關鍵因素。第36頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種→沙土保藏→斜面培養(yǎng)→液體培養(yǎng)→干燥→干孢子收集→合格成品保藏→使用前質(zhì)量檢查→合格→作為發(fā)酵用種子。干孢子液體培養(yǎng)成熟后，將淺盤傾斜，把盤內(nèi)培養(yǎng)液除去，然后培養(yǎng)盤于干燥柜中，兩端與無菌空氣進、出管道相連，通入40℃左右的無菌空氣，干燥3-4小時，在無菌條件下采用孢子收集器進行孢子收集。第37頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月

a不置換法培養(yǎng)液一次加入，發(fā)酵結(jié)束后棄去菌蓋，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。第38頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月具體操作：接種后，培養(yǎng)溫度維持在35℃，這是黑曲霉的適宜生長溫度，需維持72h左右，以促進孢子發(fā)芽及菌體發(fā)育。當溫度逐漸下降時，必須通人約50℃的空氣以維持35℃的培養(yǎng)溫度，通風量為3~5m3/m2.h。接種后20h左右可出現(xiàn)灰白色、很薄的菌膜，72h時菌膜已完全形成，菌膜相當厚且有皺褶。48h起由于菌體耗氧增加，可開動另一組風管向盤層之間通汽，進汽溫度為40℃左右，風量為7m3/m2.h，進汽濕度為75%以上，以防培養(yǎng)液水分蒸發(fā)過快。第39頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月接種后72h起進入產(chǎn)酸期，這時菌體代謝速率高，耗糖快，發(fā)酵液酸度急劇升高，并釋放出大量熱，最高時可達1000kJ/(m2.h)，此時應加強通風措施，嚴格將發(fā)酵溫度控制在26~28℃，以利檸檬酸的形成。因此，一般在進入產(chǎn)酸期前8h左右需增大風量至15~18m3/m2.h，且降低進汽溫度在25℃以下，濕度仍在75%以上。160h以后發(fā)酵結(jié)束。第40頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月b

置換法置換法一般是采用糖濃度低而營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)液先培養(yǎng)菌蓋，待菌蓋形成之后再更換發(fā)酵培養(yǎng)基?？筛鼡Q1次也可數(shù)次，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。第41頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)菌蓋，一般使用5%的糖液，視糖蜜質(zhì)量再補充少量NH4NO3、K2HPO4等鹽類。接種孢子后，室溫保持在34~36℃，培養(yǎng)液品溫為32~34℃，使孢子發(fā)芽，正常情況下40h即可形成緊密有皺的菌蓋。菌蓋形成后，放掉培養(yǎng)基，更換發(fā)酵培養(yǎng)基(即第1次置換)，并將室溫降至30~32℃，待發(fā)酵48~60h后再放掉發(fā)酵液，加入新培養(yǎng)液即進行第2次置換。如此重復，一般可置換培養(yǎng)基8~10次，總發(fā)酵周期為14~20d，收集起來的發(fā)酵液，用來提取檸檬酸。第42頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月置換法的優(yōu)點是節(jié)省了大量培菌時間，發(fā)酵速度快，而且原本不適宜長菌的原料都可用作發(fā)酵培養(yǎng)基。但為了保持菌蓋的高活性，不能將發(fā)酵液殘?zhí)强刂频煤艿?，這樣一來就造成替換出來的發(fā)酵液其殘?zhí)橇枯^高，給后道提取檸檬酸帶來困難。第43頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月c

不置換法影響表面發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)液層厚度

培養(yǎng)基液層厚度大，發(fā)酵產(chǎn)物總的生成量就大。如果原料質(zhì)量好，預處理方法得當，曲霉菌絲體活力強，那末可適當增加液層厚度;相反，就應減少液層厚度。第44頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月c

不置換法影響表面發(fā)酵的因素2.糖濃度

用于表面發(fā)酵的糖蜜濃度，質(zhì)優(yōu)的糖蜜濃度(以蔗糖濃度計)為18%~22%較適宜，而質(zhì)劣的糖蜜一般采用14%。在表面發(fā)酵中，大約80%的糖被用于合成檸檬酸，菌體生長增殖耗糖8%左右，菌體進行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副產(chǎn)物。第45頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月3.溫度黑曲霉生長最適溫度33-37℃，積累檸檬酸的最適溫度在32℃黑曲霉適宜產(chǎn)酸溫度是26~28℃。溫度高，容易形成雜酸等副產(chǎn)物且菌體易衰老；溫度低，發(fā)酵周期被延長。第46頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月4.

pH值

黑曲霉長菌的最適pH為中性，而產(chǎn)酸的最適pH在2.5~2.0。因此，應該注意的是：菌蓋形成之后，只是在菌蓋下面有一個低pH區(qū)域，菌體合成檸檬酸的活動都是在這低pH區(qū)域內(nèi)進行的，所以不應該攪動發(fā)酵液，避免低值區(qū)域的pH值上升而長菌不產(chǎn)酸。第47頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月黑曲霉發(fā)酵檸檬酸，pH3.0以下積累檸檬酸，pH3.0以上積累草酸，pH5.0容易積累葡萄糖酸與不同碳源有關，黑曲霉在合成培養(yǎng)基上產(chǎn)檸檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯干粉4.5第48頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月5、通風

表面發(fā)酵是氣相傳氧，因此傳氧效率較高，所以只要保持發(fā)酵室內(nèi)有適當空氣流通就可以滿足霉菌對氧的需要。較高度的CO2會影響菌體的生長和降低產(chǎn)酸能力。一般將CO2控制在3%以下。第49頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月二）

固體發(fā)酵

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淺盤發(fā)酵第51頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月a

淺盤發(fā)酵將曲置于曲室內(nèi)培養(yǎng)，室溫可按需要調(diào)節(jié)。在孢子發(fā)芽和菌絲生長期，由于產(chǎn)生的熱量少，品溫會逐漸下降，在入室后自18h內(nèi)，應維持品溫在27~31℃。培養(yǎng)18~48h期間，由于發(fā)酵熱的大量釋放，品溫上升很快，應采取措施，不得讓品溫超過43℃菌體活力下降，所以品溫會下降，此時應維持在35℃左右，直至發(fā)酵結(jié)束。第53頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月為了克服上、下曲盤的溫差，在發(fā)酵40h左右時應將曲盤上下對調(diào)。整個發(fā)酵期間不必翻曲。曲室相對濕度在85%~90%。發(fā)酵終點根據(jù)酸度來判定，從48h開始測量酸度，以后每隔12h測定1次，自72h以后則每隔4h測定1次，在酸度達到最高時即出料，否則時間延長，檸檬酸反而被菌體消化。第54頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月b

厚層通風發(fā)酵第55頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月機械通風固體曲發(fā)酵設備

1一輸送帶2一高位料斗3一送料小車4一曲料室5一進出料機6一料斗7一輸送帶8一鼓風機9一空調(diào)室10一循環(huán)風道11-室閘門第56頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月b

厚層通風發(fā)酵與淺盤發(fā)酵明顯不同的是，在物料鋪攤厚度上，厚層發(fā)酵的曲醅厚度在50cm左右，比淺盤發(fā)酵的15~20cm要大出許多。為了給曲霉菌提供氧，在培養(yǎng)過程中需要進行機械通風。第57頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月三）液體深層發(fā)酵

1.工藝流程

第58頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2.生產(chǎn)工藝條件（1）碳氮源薯干原料由于產(chǎn)地等客觀條件不同，其組織中各物質(zhì)的含量各異，其蛋白質(zhì)含量差異較大，因此應根據(jù)不同的原料來調(diào)整培養(yǎng)基的成分。（2）發(fā)酵溫度黑曲霉發(fā)酵檸檬酸溫度控制在28~30℃，檸檬酸產(chǎn)率最高，發(fā)酵速度較快，超過35℃時，雖然初期產(chǎn)酸較快，但最終的發(fā)酵產(chǎn)率降低15%以上。為了節(jié)約降溫能耗，我國成功培育出高溫發(fā)酵的產(chǎn)酸微生物，可以在37℃發(fā)酵。第59頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）pH在薯干粉發(fā)酵檸檬酸中，初始pH不加調(diào)節(jié)，為自然，約5.5。當接入菌種后，菌種生長繁殖，消耗氮源和銨離子，使培養(yǎng)基的PH下降，前期pH下降較快，在12h左右，活力強的菌種微生物培養(yǎng)12h后，ph可以降至2.5~3.0，24小時后可以降至2.2-2.3，這時會有少量的檸檬酸產(chǎn)生，但要到48小時后檸檬酸才大量產(chǎn)生，才使pH下降至2.0以下第60頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）控制生物量正常德發(fā)酵液中生物量控制在12-20g/L，過多的生物量影響氧的溶解，增加發(fā)酵罐的攪拌，且消耗大量的葡萄糖，如果生物量的過渡生長，檸檬酸的產(chǎn)率則迅速下降。第61頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）嚴防缺氧檸檬酸是耗氧發(fā)酵，對氧十分敏感，當發(fā)酵進入產(chǎn)酸期時只需要幾分鐘的缺氧時間，就會造成嚴重影響，甚至完全失敗。對于突然停電等在所難免的事故，要采取緊急的補救措施，關閉進氣閥，迅速啟動備用電源，防止發(fā)酵罐料液倒流到空氣過濾器中，用滅過菌的碳酸鈣或石灰乳中和發(fā)酵液pH至2.5-3.5，然后恢復正常操作。第62頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月（6）孢子接種數(shù)與菌球體的特征檸檬酸發(fā)酵液中的菌球體是有一個或數(shù)個孢子在生長過程物理作用形成的。菌球體的大小和數(shù)量關系到發(fā)酵的成敗，一般來講，菌球體越小、越多，產(chǎn)酸就越高，發(fā)酵周期也越短。菌球體的大小和數(shù)量與孢子接種量有關。接種孢子數(shù)與球菌體個量成正比，與菌球體直徑成反比，孢子數(shù)量不足，菌球體大或大小不一致，實踐證明，種子罐菌球體平均在0.2-0.5mm，移入發(fā)酵罐后菌球體增長至1-2.0mm的范圍較佳。菌球體最佳濃度為280個/ml，小于120個/ml檸檬酸積累速率和轉(zhuǎn)化率下降，當大于360個/ml時，前期產(chǎn)酸快，后期緩慢。第63頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月第64頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月3檸檬酸發(fā)酵染菌及防治1）常見污染菌大腸桿菌肺炎克雷伯氏菌熒光假單胞菌枯草芽孢桿菌葡萄酒假絲酵母皺褶青霉泡盛曲霉黃曲霉第65頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月2）污染途徑及防治1菌種制備、保藏及擴大培養(yǎng)過程染菌2培養(yǎng)基滅菌不徹底3發(fā)酵過程中染菌污染途徑：。。。？第66頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)酵過程染菌途徑：A滅菌后罐壓凋零；B發(fā)酵設備滲漏；C空氣染菌；D軸封不嚴；E操作不當，泡沫溢出。第67頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月3）雜菌污染的檢查顯微鏡檢查平板培養(yǎng)檢查第68頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌第69頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月肺炎克雷伯氏菌第70頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光假單胞菌第71頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月枯草芽孢桿菌第72頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月葡萄酒假絲酵母菌第73頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月皺褶青霉第74頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月泡盛曲霉第75頁，課件共83頁，創(chuàng)作于2023年2月黃曲霉第76頁，