生物化學(xué)動(dòng)物細(xì)胞工程制藥

生物化學(xué)動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第1頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

動(dòng)物細(xì)胞作為一種重要的宿主細(xì)胞，可用以下藥物的生產(chǎn)：病毒疫苗其他的各種重組蛋白單克隆抗體第2頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.1動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性3.2生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得3.3動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基3.4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法3.5動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式3.6動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器3.7動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例3.8動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望第3頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.1動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)

離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞主要為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)是否需要帖附于支持物上生長(zhǎng)的性質(zhì)，可將動(dòng)物細(xì)胞分為貼壁依賴型和懸浮型兩類。1、貼壁依賴型

絕大多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)必須貼附在某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)。按培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁的形態(tài)主要分為4類。第4頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）成纖維細(xì)胞型形狀與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似而得名，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則三角形。（2）上皮細(xì)胞型形狀為扁平的不規(guī)則多角型。（3）游走細(xì)胞型在支持物上分散生長(zhǎng)，不連接成片，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)。（4）多形性細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。

第5頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、懸浮型

少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)呈懸浮生長(zhǎng)，來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞為懸浮型。形態(tài)常為球形，可懸浮培養(yǎng)。3、兼性貼壁細(xì)胞

不嚴(yán)格的依賴支持物某些情況下可在培養(yǎng)基中良好懸浮生長(zhǎng)。第6頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特征動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一些基本概念：

動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)）。

原代培養(yǎng)是指從機(jī)體取出組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過(guò)程。傳代培養(yǎng)是指從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系。通過(guò)選擇或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得的具有特異性質(zhì)或標(biāo)記的細(xì)胞，稱為細(xì)胞株。不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限的細(xì)胞系或細(xì)胞株稱為有限細(xì)胞系或細(xì)胞株。第7頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月可連續(xù)傳代的細(xì)胞系或細(xì)胞株稱為連續(xù)細(xì)胞系或細(xì)胞株。有限細(xì)胞系（株）可通過(guò)自發(fā)、病毒感染、癌基因轉(zhuǎn)移、與其他連續(xù)細(xì)胞融合等方法轉(zhuǎn)化得到連續(xù)細(xì)胞系（株）。動(dòng)物細(xì)胞的生理特征:1.細(xì)胞分裂周期長(zhǎng)（12~48h）

2.細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附基質(zhì)，存在接觸抑制3.正常二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)壽命有限第8頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、動(dòng)物細(xì)胞的生理特征4.對(duì)周圍環(huán)境十分敏感5.對(duì)培養(yǎng)基要求高

氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子、血清等。6.對(duì)蛋白合成途徑和修飾與細(xì)菌不同（糖基化）目前，動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌生產(chǎn)的產(chǎn)品，產(chǎn)值約各占一半。第9頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.2生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求

原代細(xì)胞－－－二倍體細(xì)胞－－－連續(xù)細(xì)胞

腺病毒疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗事故（錯(cuò)用癌細(xì)胞）

皮下注射癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最終產(chǎn)品殘留DNA嚴(yán)格限制。

第10頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

1986年，從淋巴瘤患者分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞Namalwa細(xì)胞，生產(chǎn)干擾素用于臨床。猴腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞Vero生產(chǎn)狂犬疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗被批準(zhǔn)大量用于人群。1987年，雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)OKT3單抗用于臨床排異反應(yīng)。1988年后，大批異倍體傳代細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白被批準(zhǔn)上市。

最終產(chǎn)品殘留DNA嚴(yán)格限制。

第11頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得

1 .原代細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)粉碎、消化得到的細(xì)胞懸液。

需要大量動(dòng)物。雞胚細(xì)胞、原代兔腎或鼠腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞。2.二倍體細(xì)胞系通過(guò)篩選、克隆從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的具有某種特征的有限細(xì)胞株有限增殖、2n、貼壁、接觸抑制

MRC-5、WI-38第12頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

MRC-5：

1966年，14周正常男性胎肺組織中獲得2n=46

壽命42~46代用于人用疫苗的生產(chǎn)3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系

通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成，常由于染色體斷裂成為異倍體。自發(fā)形成，嚙齒動(dòng)物細(xì)胞多發(fā)；病毒感染后轉(zhuǎn)化；直接從動(dòng)物腫瘤組織中建立的細(xì)胞系。

轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有無(wú)限生命力，一般倍增時(shí)間短、對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子要求較低。

第13頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）、COS、BHK-21、Namalwa、Vero細(xì)胞等。

COS細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）：1981年，Gluzman用復(fù)制起點(diǎn)缺失的SV40(猿猴空泡病毒40)轉(zhuǎn)化非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1，獲得3個(gè)細(xì)胞系：COS-1、COS-3、COS-7。COS細(xì)胞組成性表達(dá)SV40大T抗原，帶有SV40ori復(fù)制子的質(zhì)粒以附加體的形式高拷貝擴(kuò)增（105拷貝）大量擴(kuò)增質(zhì)粒及高表達(dá)mRNA、蛋白質(zhì)，易回收和分析易培養(yǎng)、易轉(zhuǎn)染。第14頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

CHO-K1細(xì)胞：1957年，Puck等從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢分離，上皮樣細(xì)胞。

CHO-dhfr-

為二氫葉酸還原酶突變型(培養(yǎng)時(shí)需加入次黃嘌呤、胸苷)，用于工程細(xì)胞構(gòu)建。

第15頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、融合細(xì)胞系

細(xì)胞融合：兩個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。主要為雜交瘤細(xì)胞。

細(xì)胞自發(fā)融合的頻率很低，需要采用人工的方式進(jìn)行細(xì)胞融合，方法有3種：生物方法（病毒）、化學(xué)方法（PEG）、物理方法（電融合）

目前，常用的為PEG和電融合。第16頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）病毒誘導(dǎo)融合可促進(jìn)細(xì)胞融合的病毒有：皰癥病毒、天花病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。

仙臺(tái)病毒為副黏液病毒的一種，對(duì)人危害小而且有效，使用最廣。

起融合作用的為病毒被膜上的糖蛋白。細(xì)胞融合時(shí)加入滅活的仙臺(tái)病毒，兩個(gè)細(xì)胞在病毒的黏結(jié)作用下靠近，通過(guò)病毒與細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜相互融合。細(xì)胞融合率較低，而且還需病毒，現(xiàn)已很少使用。第17頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）PEG融合

誘導(dǎo)融合的機(jī)理還不明確。

PEG（聚乙二醇）為乙二醇的線性多聚體，結(jié)構(gòu)式為H(OCH2CH2)nOH，分子量1000以上為固體，1000以下為液體。用于細(xì)胞融合的PEG分子量一般為1000~6000，濃度為30~50%。融合效率最高可達(dá)10%。3、電融合

細(xì)胞在強(qiáng)電場(chǎng)脈沖的作用下，細(xì)胞膜上會(huì)短暫出現(xiàn)小孔，如果兩個(gè)細(xì)胞貼近，電脈沖時(shí)緊貼的質(zhì)膜會(huì)瞬時(shí)破裂而導(dǎo)致膜的融合，從而形成雜合細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：融合率很高、對(duì)細(xì)胞毒性低、適合各種細(xì)胞、可用于細(xì)胞數(shù)量很少的融合過(guò)程。第18頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)胞融合需要經(jīng)細(xì)胞膜融合、細(xì)胞質(zhì)滲透、細(xì)胞核融合等主要步驟。第19頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

預(yù)處理融合方法主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞不需仙臺(tái)病毒、PEG、電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細(xì)胞脫壁PEG、電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細(xì)胞脫壁PEG高產(chǎn)優(yōu)良新菌種第20頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、重組工程細(xì)胞系構(gòu)建含目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體（病毒載體、質(zhì)粒載體）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)選擇標(biāo)記篩選工程細(xì)胞

瞬時(shí)表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)生產(chǎn)上為了獲得高效穩(wěn)定表達(dá)的工程細(xì)胞株。

第21頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第22頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、細(xì)胞庫(kù)的建立

除原代細(xì)胞，其他細(xì)胞系或株需要建庫(kù)保存。原始細(xì)胞庫(kù)（mastercellbank，MCB）

二倍體細(xì)胞：群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞（傳代次數(shù)盡可能少的細(xì)胞）記錄詳細(xì)檔案工作細(xì)胞庫(kù)（workingcellbank，WCB）

生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（manufacturer’sworkingcellbank，MWCB）

生產(chǎn)第23頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.3動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件1、器材的清洗新的玻璃：泡酸（5%鹽酸12h）、刷洗、清潔液泡12h（重鉻酸鉀-硫酸洗液）、沖洗2、水質(zhì)

新鮮的超純水、雙蒸水或三蒸水無(wú)熱原

第24頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、pH值

最適pH為7.2～7.4，低于6.8或高于7.6對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利

酚紅

細(xì)胞代謝產(chǎn)乳酸Na2HPO4/NaH2PO4、NaHCO3/CO2

HEPES(pKa7.6)10~50mMMOPS、DIPSO等。

4、滲透壓

理想的滲透壓可保持在290～300mOsm(milli

-

osmol

)/kg，可通過(guò)增減NaCl的量調(diào)節(jié)。

1mg/mlNaCl32mOsm/kg1mol葡萄糖/kg水冰點(diǎn)-1.858

℃1000

mOsm/kg冰點(diǎn)-0.186

℃100

mOsm/kg

第25頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）維持滲透壓、pH

第26頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、溫度

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，可在25～35℃生存和生長(zhǎng)，40℃以上只能存活幾十分鐘到幾個(gè)小時(shí)。6、氧氣和二氧化碳

二氧化碳主要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，二氧化碳的比例可為3~5%；氧氣影響細(xì)胞生長(zhǎng)，溶氧過(guò)高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，過(guò)低抑制細(xì)胞生長(zhǎng)?？刹捎貌煌壤难鯕狻⒌?dú)?、二氧化碳和空氣加以調(diào)節(jié)。

第27頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7、抗生素

防止微生物污染可在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。生產(chǎn)中不準(zhǔn)使用青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素。

第28頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月8、器材的消毒滅菌

物理方法：濕熱、干熱、紫外線、伽馬射線、過(guò)濾。

化學(xué)方法：化學(xué)消毒劑，主要用于空氣、表面滅菌消毒、污染物品處理。

第29頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第30頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基

不同的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求差異很大，一般無(wú)規(guī)律可循，常需要花費(fèi)很大的時(shí)間和精力確定適合的特定細(xì)胞需要的培養(yǎng)基。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基按組成大致可分為三類：天然培養(yǎng)基

包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。成分復(fù)雜、組分不穩(wěn)定、來(lái)源有限。補(bǔ)充血清的合成培養(yǎng)基在一些合成培養(yǎng)基中添加5～20%血清而成。最常用的血清為小牛血清、胎牛血清，還有馬血清等。第31頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

合成培養(yǎng)基成分明確、組分穩(wěn)定，目前商品化的有幾十種（如MEM、DMEM、RPMI1640、199等），主要由成分包括：氨基酸必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他種類氨基酸；維生素能源物質(zhì)（葡萄糖、谷氨酰胺）無(wú)機(jī)鹽緩沖體系其他成分如核酸前體物質(zhì)（腺苷、鳥苷等）、脂類物質(zhì)等第32頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月血清的作用：提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種生長(zhǎng)因子和激素提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼附因子和伸展因子提供可識(shí)別金屬離子、激素、維生素、脂質(zhì)的結(jié)合蛋白提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的脂肪酸和微量元素。第33頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月含血清培養(yǎng)基的缺點(diǎn)：血清的來(lái)源和批次不同導(dǎo)致培養(yǎng)差異血清的保存期有限血清很容易污染雜菌血清可能含病毒和支原體血清本身所含蛋白增加了產(chǎn)品的分離純化難度血清供應(yīng)問(wèn)題成本高第34頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)血清的培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中添加一些特殊成分而成：激素和生長(zhǎng)因子(胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等)結(jié)合蛋白（鐵傳遞蛋白、白蛋白）帖附和伸展因子（纖維結(jié)合蛋白膠原、一些多肽）其他有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：

提高了細(xì)胞培養(yǎng)的重現(xiàn)性、減少了血清帶來(lái)的污染問(wèn)題、供應(yīng)充足、產(chǎn)品易于純化。第35頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第36頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程通常包括5個(gè)時(shí)期：1、游離期

又稱懸浮期，細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液為懸浮狀態(tài)，細(xì)胞為球形。10min～4h。2、貼壁期細(xì)胞附著在固體表面，在培養(yǎng)開(kāi)始后10min～4h貼壁。細(xì)胞貼壁需要特殊的表面或其他物質(zhì)，如膠原、玻璃、塑料等。血清中含有促進(jìn)細(xì)胞貼壁的球蛋白、膠原、纖黏素等糖蛋白（促貼壁因子），這些蛋白帶正電荷，先吸附于固體表面，細(xì)胞再吸附在這些促貼壁因子表面。

第37頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、潛伏期

細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，但無(wú)細(xì)胞分裂。6h～24h。4、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞活力最高，生長(zhǎng)速度最快。5、停止期（平臺(tái)期）固體表面長(zhǎng)滿細(xì)胞，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。第38頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

1、細(xì)胞分離（1）離心分離從含有細(xì)胞體液中分離低速離心（800~1000rmp,5～10min）（2）消化分離

組織塊－－剪碎－－消化液消化－－細(xì)胞懸液－－洗滌－－細(xì)胞

消化液：胰蛋白酶、EDTA、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶等。

第39頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2、細(xì)胞計(jì)數(shù)（1）自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)無(wú)法區(qū)分死活細(xì)胞無(wú)法區(qū)分單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)

（2）血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)

采用臺(tái)盼藍(lán)或苯胺黑染色后計(jì)數(shù)可區(qū)分死活細(xì)胞。（3）結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法結(jié)晶紫染色液（結(jié)晶紫+檸檬酸）能使細(xì)胞分離破碎，細(xì)胞核染成藍(lán)色，在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核即得細(xì)胞數(shù)。（4）MTT(四甲基偶唑鹽)染色計(jì)數(shù)

MTT（淡黃）被活細(xì)胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿募自绿妫╢ormazan，紫色），溶于脫色液，比色從標(biāo)準(zhǔn)曲線得細(xì)胞數(shù)。

第40頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3、細(xì)胞傳代（1）懸浮細(xì)胞稀釋傳代

（2）貼壁細(xì)胞

消化液（胰酶）消化－－－倒去消化液－－－加入含血清的培養(yǎng)基－－－傳代

第41頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（1）凍存液氮（-196℃

）保存凍存時(shí)細(xì)胞狀態(tài)良好密度1×106~2×106/ml

加10%DMSO(二甲基亞砜)或甘油降溫速度1℃/min

（2）復(fù)蘇

快融從液氮罐中取出立即放入37~40℃水浴中。離心換液或解凍后直接加培養(yǎng)基培養(yǎng)，4～6h貼壁后立即換液。第42頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.5動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模的培養(yǎng)方法分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、假懸浮培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)）等。

1、懸浮培養(yǎng)適用于非貼壁依賴性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。適應(yīng)于兼性貼壁細(xì)胞。

Wellcome公司8000L攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)Namalwa細(xì)胞產(chǎn)干擾素。

Celltech公司2000L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)單抗。第43頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附在固體表面生長(zhǎng)以單層膜的形式生長(zhǎng)，適用于貼壁依賴性細(xì)胞與兼性貼壁細(xì)胞。

動(dòng)物細(xì)胞一般帶負(fù)電、帶正電荷的固體表面較理想有利于粘附細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)的材料可采用玻璃和一次性塑料（通常為聚苯乙烯）等。聚苯乙烯表面疏水，與細(xì)胞的相容性不好，經(jīng)過(guò)γ

射線、化學(xué)法和放電表面改性增強(qiáng)其表面電荷和浸潤(rùn)性能，成為細(xì)胞培養(yǎng)的理想材料。第44頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

1~5L的旋轉(zhuǎn)瓶簡(jiǎn)單、比表面積小、勞動(dòng)強(qiáng)度大。以貼壁培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他操作方式可采用采用其他培養(yǎng)方式如微載體培養(yǎng)，中空纖維膜反應(yīng)器培養(yǎng)。第45頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、微載體培養(yǎng)

微載體為直徑為100~250um，適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的球狀顆粒。微載體培養(yǎng)指將細(xì)胞貼附在微載體上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)體系的比表面積大，可隨載體濃度的改變而改變，細(xì)胞培養(yǎng)密度較高培養(yǎng)體系均勻，培養(yǎng)重復(fù)性好培養(yǎng)基的利用率高取樣后很容易通過(guò)顯微鏡觀察載體表面的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況收獲細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物簡(jiǎn)單放大容易對(duì)人工和空間的需求低第46頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

優(yōu)良的微載體一般要具有以下特性：

載體表面與細(xì)胞相容性良好，帶較低的正電荷，適于細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)微載體的相對(duì)密度略大于培養(yǎng)基，在1.03~1.05之間，輕度攪拌就能時(shí)載體懸浮起來(lái)，停止攪拌很很快沉淀顆粒粒度分布均勻，表面光滑利于細(xì)胞鋪展載體透明，容易用顯微鏡直接對(duì)細(xì)胞觀察材料無(wú)毒性載體材料為非剛性材料，避免培養(yǎng)過(guò)程中相互碰撞損傷細(xì)胞可以高溫滅菌惰性，不吸收或少吸收培養(yǎng)基組分能重復(fù)使用，價(jià)廉第47頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

微載體的材料有聚苯乙烯、葡聚糖、纖維素、膠原等。第48頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

多孔微載體：極大增大了比表面積

加鈦載體（高比重，適用于流化床反應(yīng)器）普通載體

第49頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、微囊化培養(yǎng)

指將動(dòng)物細(xì)胞包裹在親水的球狀半透性薄膜形成的微囊內(nèi)。營(yíng)養(yǎng)成分能透過(guò)，但細(xì)胞不能出來(lái)。適用于貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：減少了攪拌、通氣對(duì)細(xì)胞的影響細(xì)胞在微小的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，能達(dá)到很高的細(xì)胞密度制備動(dòng)物細(xì)胞微囊的材料通常為海藻酸鹽和多聚賴氨酸（分子量一般在40,000~80,000）。第50頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

海藻酸鹽是由D-甘露糖醛酸和L-古羅糖醛酸通過(guò)1,4糖苷鍵連接而成。第51頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月動(dòng)物細(xì)胞微囊化：

海藻酸聚陰離子和聚賴氨酸聚陽(yáng)離子形成聚電解質(zhì)的膜。第52頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

5.包埋培養(yǎng)采用各種凝膠進(jìn)行包埋后培養(yǎng)，主要的凝膠載體為海藻酸凝膠、瓊脂糖等。動(dòng)物細(xì)胞包埋后細(xì)胞活性不高，很少采用。6.結(jié)團(tuán)培養(yǎng)某些結(jié)團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞細(xì)胞本身作為貼附基質(zhì),可加入直徑較小的顆粒（20um）促進(jìn)結(jié)團(tuán)

第53頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式

分為分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)。

1、分批培養(yǎng)2、流加培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中反應(yīng)體積不斷增加。流加培養(yǎng)可以補(bǔ)充細(xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于較好的環(huán)境中生長(zhǎng)，有利于產(chǎn)物的形成和細(xì)胞濃度提高。可避免高濃度基質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。第54頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、半連續(xù)培養(yǎng)

培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度，取出部分培養(yǎng)液，同時(shí)反應(yīng)器中補(bǔ)加相同的體積的培養(yǎng)基，再按分批操作的方式進(jìn)行培養(yǎng)。又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、可反復(fù)收獲產(chǎn)品

4、連續(xù)培養(yǎng)

培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。細(xì)胞生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率和稀釋率相同時(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。

優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境良好穩(wěn)定、可連續(xù)不斷獲得產(chǎn)品和細(xì)胞。第55頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、灌流培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)至一定程度后，將新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，同時(shí)將不含細(xì)胞的培養(yǎng)液不斷取出，細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)。灌注培養(yǎng)可保持細(xì)胞良好的培養(yǎng)條件，不斷排出有害代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)細(xì)胞能達(dá)到很高的濃度，連續(xù)收獲產(chǎn)品。第56頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第57頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.6動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模較小，100L以上即為生產(chǎn)規(guī)模。1、轉(zhuǎn)瓶仍然用于一些病毒疫苗的生產(chǎn)和細(xì)胞種子培養(yǎng)。2、通氣攪拌式反應(yīng)器

動(dòng)物細(xì)胞不耐剪切力，而且培養(yǎng)基容易產(chǎn)生泡沫。

用于動(dòng)物細(xì)胞的攪拌式反應(yīng)器的通氣裝置和攪拌槳具有特殊的結(jié)構(gòu)，可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。聚丙烯中空纖維膜或薄硅膠管園底、高徑比1～1.5:1第58頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第59頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、氣升式反應(yīng)器

氣體通過(guò)反應(yīng)器底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流筒，使得到流筒中的液體總體密度低于外部區(qū)域，從而一直上升，導(dǎo)致液體在反應(yīng)器中循環(huán)。高徑比大10:1。

氣泡直徑1~2mm

空氣流速0.01~0.06vvm

剪切力小，混合均一氧和營(yíng)養(yǎng)的傳遞好有利于設(shè)備的密封

第60頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、中空纖維膜反應(yīng)器

由很多中空纖維膜（一般為超濾膜）組成的反應(yīng)器。結(jié)構(gòu)上分為管外空間和管內(nèi)空間，細(xì)胞在管外空間生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞可貼在膜外表面生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞可管外空間懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)基從中空纖維管內(nèi)通過(guò)，養(yǎng)分和溶氧通過(guò)膜的擴(kuò)散到管外，代謝廢物擴(kuò)散至管內(nèi)被帶走。用途較廣。

細(xì)胞培養(yǎng)密度高

108/ml

細(xì)胞分裂停止

代謝和分化功能可保持?jǐn)?shù)月第61頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、平板膜反應(yīng)器

懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞

第62頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6、流化床和固定床反應(yīng)器

第63頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第64頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.7動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例一、類淋巴細(xì)胞干擾素(Na-IFN-α，interferonIFN)

由Namalva細(xì)胞（淋巴瘤患者中分離獲得）生產(chǎn)

攪拌罐生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)（8000L）

80%IFN-α(多種亞型)＋20%IFN-β細(xì)胞逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)（8000L）10%小牛血清RPMI16401×106/ml丁酸鈉或IFN啟動(dòng)仙臺(tái)病毒誘生單抗或多抗親和層析TCA沉淀超濾濃縮收獲離心Na-IFN-α48h18hSephadexG75第65頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）

人t-PA基因位于第8號(hào)染色體p12~q11.2區(qū)

14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子

全長(zhǎng)36,594bp

t-PA為單鏈

527aa

MW67,000~72,000

等電點(diǎn)7.8~8.6,pH5.8~8.0穩(wěn)定17對(duì)二硫鍵三個(gè)糖基化位點(diǎn)第66頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

275Arg-276Ile

能被纖溶酶、組織激肽釋放酶作用裂解成雙鏈。第67頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月作用機(jī)理：游離t-PA對(duì)纖溶酶原親和力很低，不產(chǎn)生激活作用。

t-PA對(duì)血栓中纖維蛋白有很強(qiáng)親和力，與纖維蛋白結(jié)合后的t-PA能夠激活纖溶酶原，形成纖溶酶，纖溶酶在血栓部位水解纖維蛋白，使血栓溶解。少量進(jìn)入血液的纖溶酶能可被α2-抗纖溶酶作用失活。纖維蛋白t-PAt-PA纖溶酶原纖溶酶纖溶酶α2－抗纖溶酶第68頁(yè)，課件共76頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月t-PA的生產(chǎn)：

采用CHO工程細(xì)胞株生產(chǎn)

微載體攪拌式灌流培養(yǎng)、流化床灌流培養(yǎng)

Verax2000(24L)流化床反應(yīng)器

灌流330L/d，20g/d,27d