蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定詳解課件

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定第三章7/22/20231蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的組成、排列順序連接方式和二硫鍵的位置。在生物化學(xué)與分子生物學(xué)中不少問題都面臨著需要知道蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的情況。如研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、一級結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系等。因此，只有把一級結(jié)構(gòu)研究清楚之后，我們才能研究生命過程中的許多復(fù)雜問題。7/22/20232蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的程序蛋白質(zhì)的提純樣品蛋白質(zhì)的分子量確定蛋白質(zhì)分子中含有幾條肽鏈蛋白質(zhì)N端和C端的測定確定蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成比二硫鍵和酰胺基的確定一級結(jié)構(gòu)的確定7/22/20233

在進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測定時，第一步工作就是提純蛋白，用于測序的蛋白樣品中不能含有雜蛋白，一般純度要求達(dá)到97%以上或能形成結(jié)晶。樣品的純度需用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。7/22/20234

天然蛋白質(zhì)分子量的測定，對于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定是十分重要的信息。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和蛋白質(zhì)分子中氨基酸的平均分子量，可以大致估計蛋白質(zhì)分子中氨基酸組成的數(shù)目。在蛋白質(zhì)序列測定中，對分子量測定的要求不高，誤差小于10%即可以。分子量的測定立法主要有：

SDS-凝膠電游泳法、超速離心法、滲透壓法和層析法等。7/22/20235對蛋白質(zhì)分子量測定以后，經(jīng)過亞單位的拆分，比較分子量有無變化。如無變化，說明蛋白質(zhì)是由一條肽鏈所構(gòu)成；若發(fā)生了變化，說明蛋白質(zhì)是由多條肽鏈所構(gòu)成。假如是由多條肽鏈構(gòu)成的，還要知道是相同的肽鏈還是不同的肽鏈所組成以及待分析的蛋白質(zhì)由幾條肽鏈所組成，這個工作可以用聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行測定。7/22/20236

大多數(shù)蛋白質(zhì)分子中都含有半胱氨酸，兩個半胱氨酸之間可以形成二硫鍵，如蛋白質(zhì)分子中含有多個二硫鍵時，必須正確判斷二硫鍵的位置，天然蛋白質(zhì)中只有一種正確的二硫鍵的形成方式，如果二硫鍵的位置發(fā)生錯配，將失去蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。如有多條二硫鍵時，存在有多種形成方式，如牛胰核糖核酸酶有四條二硫鍵，存在108種可能的配對方式，但只有一種方式是有生物學(xué)活性。因此，在測序時，必須明確測出二硫鍵的正確位置。7/22/20237氨基酸與肽的定量組成測定

定量組成測定，第一步是將蛋白質(zhì)水解為基組成氨基酸。

蛋白質(zhì)的水解方法有：1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真空的安瓿瓶內(nèi)進(jìn)行，水解10~24小時特點：（2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來而轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的氨基酸，酰胺基的總量由產(chǎn)生的氨算出。（1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破壞。7/22/202382、堿水解法：蛋白質(zhì)與堿共熱而發(fā)生水解。特點：（1）堿水解引起全部氨基酸的消旋（2）堿水解引起半胱氨酸、胱氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸的破壞（3）堿水解能保留所有的色氨酸7/22/202393、酶水解法：是最溫和的水解方法。特點：（1）能保留住所有氨基酸的性質(zhì)和天然構(gòu)型（2）酶也是蛋白質(zhì)，水解待測蛋白質(zhì)的同時，自身也會被水解而改變氨基酸的組成比。在測定蛋白質(zhì)的組成比時，要三種方法同時使用，互相比較最后得出真實的蛋白質(zhì)中氨基酸的組成比。7/22/202310氨基酸的衍生分離及檢測2，4-二硝基氟苯法（DNP）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）鄰苯二甲醛法（OPT）7/22/202311氨基酸組成測定7/22/2023127/22/202313氨基酸自動分析儀原理圖7/22/202314多肽鏈的末端分析（氨基）端的測定（1）2，4-二硝基氟苯法（DNP）（2）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）（3）異硫氰酸苯酯（PITC）-Edman降解法（羧基）端的測定（1）硼氫化鋰法（2）肼解法（3）羧肽酶法7/22/202315

2,4-二硝基氟苯法：英國的科學(xué)家F.Sanger于1945年提出，是一個理想的氨基端測定試劑。2,4-二硝基氟苯在很溫和的條件下（室溫，pH8），就能與氨基酸的氨基、多肽或蛋白質(zhì)的氨基末端進(jìn)行反應(yīng)，生成黃色的二硝基氟苯衍生物（DNP蛋白等）。

7/22/202316DNP蛋白在6M鹽酸，105℃，16小時進(jìn)行完全水解，只有N末端的氨基酸與2,4-二硝基氟苯反應(yīng)生成二硝基氟苯氨基酸。用乙醚提出后與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一起進(jìn)行濾紙或薄層層析，對照鑒定末端氨基酸確定待測蛋白的氨基末端。7/22/202317

氨基端的分析7/22/2023187/22/202319

丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley等1956年報告了丹磺酰氯與氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)產(chǎn)生黃色的熒光，由此產(chǎn)生了測定N末端的新方法，稱DNS法。本法測定N末端的原理與DNP法有相似之處。但比DNP法的靈敏度提高了100倍，使用更為廣泛。

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本法的優(yōu)點：（1）在相當(dāng)溫和的條件下就能與蛋白質(zhì)的肽鏈的N端氨基反應(yīng)且反應(yīng)產(chǎn)物很耐酸水解；（2）DNS氨基酸在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生黃色熒光，可以進(jìn)行熒光測定；（3）DNS氨基酸很適于電泳和層析分離，分辨率和準(zhǔn)確度都很高，操作比較簡單。7/22/2023217/22/202322丹磺酰氯（DNS-Cl）法雙向?qū)游鲋讣y圖back7/22/202323異硫氰酸苯酯法：目前應(yīng)用最廣泛的一種氨基末端的測定方法多肽或蛋白質(zhì)與PITC在pH≈9，40℃作用時形成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質(zhì)（簡稱PTC多肽或蛋白質(zhì)）后者與酸在有機溶劑中反應(yīng)后，代表N末端的PTC氨基酸環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物而從肽鏈上掉下來，此產(chǎn)物可用氣液色譜法進(jìn)行鑒定。7/22/202324本法的優(yōu)點：（1）除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈部分仍是完整的，可以依照前法重復(fù)測定新生的N末端氨基酸。（2）可以用于自動化分析。7/22/2023257/22/2023267/22/202327硼氫化鋰法：肽鏈的C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原使成相應(yīng)的α氨基醇。肽鏈水解后，代表C末端氨基酸的α氨基醇，可用層析法加經(jīng)鑒定。back7/22/202328肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用濾紙層析法鑒定。back7/22/202329羧肽酶法：羧肽酶法是C端氨基酸測定的主要方法。羧肽酶A水解蛋白質(zhì)或多肽時，是從C端氨基酸開始的。每一次裂解下一個C端氨基酸殘基。切下第一個氨基酸以后，還可以繼續(xù)切下第二個、第三個氨基酸本法優(yōu)點：按順序從C端釋放出一個或n個氨基酸殘基，從而推斷了蛋白質(zhì)的C末端或C端的幾個氨基酸的排列順序。本法的局限性：不能切下甘氨酸、堿性氨基酸，也不能切下脯氨酸或與脯氨酸相連的氨基酸。羧肽酶A能迅速釋放的C端氨基酸有：Tyr、Phe、Trg、Leu、Ile、Met、Thr、Gln、His、Ala、Val較緩慢釋放的C端氨基酸有：Asn、Ser、Lys很緩慢釋放的C端氨基酸有：Gly、Asp、Glu、Cys7/22/202330羧肽酶A對蛋白質(zhì)的水解作用圖back7/22/202331（一）色氨酸的測定：色氨酸是組成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一，在一些蛋白質(zhì)的氨基酸組成的分析數(shù)據(jù)中經(jīng)常缺少這個氨基酸的數(shù)據(jù)，這是由于酸水解時色氨酸幾乎全部被破壞，可用堿水解法或酶水解法加以彌補，然后再進(jìn)行測定。常用的方法有以下兩種：（1）對-二甲基氨基苯甲醛法：含有色氨酸的堿水解液加入對-二甲基氨基苯甲醛的濃硫酸溶液和亞硝酸鈉溶液，強酸條件下反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，590nm測定光吸收值，此法現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。7/22/202332（2）三價鐵顯色法：含有色氨酸的樣品，與鐵離子的醋酸溶液混合，加入濃硫酸，振蕩之后呈玫瑰紅色，在545nm比色測定。此法測定簡便、快速，線性關(guān)系較好。但反應(yīng)混合物中的含水量對顯色有一定影響。因此，不如對-二甲基氨基苯甲醛法使用廣泛。7/22/202333巰基的測定：巰基在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的研究中比其它基團(tuán)更為重要，因此更引起人們的注意。測定巰基的方法有很多，不能說那一方法最好，由于pH、緩沖液、巰基與試劑反應(yīng)能力以及蛋白質(zhì)分子的變性程度等因素的影響，必須比較不同方法的分析結(jié)果之后才能得出正確的結(jié)論。主要方法有：形成硫醇鹽法、烷基化法、比色法等，給大家介紹形成硫醇鹽法。7/22/202334（1）形成硫醇鹽法：重金屬與巰基反應(yīng)生成硫醇鹽衍生物蛋白質(zhì)—SH+Me+

蛋白質(zhì)—SMe+H+這些金屬離子主要有：銀、汞、銅、鎘、鋅鉛等。一般，采用不同量的金屬離子滴定巰基，并用電位測定法測定過量的試劑。7/22/202335對氯汞苯甲酸與巰基反應(yīng)，形成巰基的對氯汞苯甲酸衍生物（PCMB）。PCMB最大吸收在233nm摩爾消光值為1.96×104。與巰基形成硫醇鹽以后，增加到2.2×104從圖中可以看出在250nm處差值最大，這個差值與參與反應(yīng)的試劑量有直接關(guān)系。測定時，用含巰基化合物支滴定固定量的汞試劑，直至吸收差值不再增加為止，根據(jù)汞試劑的量可以計算出巰基數(shù)量。由于測定是在蛋白質(zhì)的吸收范圍內(nèi)進(jìn)行，因此必須作蛋白質(zhì)含量對吸收影響的校正。7/22/202336亞基的拆分：蛋白質(zhì)亞基之間是以非共價鍵聯(lián)接在一起的。如：氫鍵、疏水基團(tuán)的相互作用、離子鍵等。這些都是較弱的鍵，可以在溫和的條件下將其拆開。常用的方法有pH的改變和強變性劑（8M尿素、6M鹽酸胍等）（1）pH的改變：這是最簡便的方法，并且在很多情況下可行的方法。對蛋白質(zhì)來講，解離的臨界pH范圍大約在pH3~4（羧基滴定范圍）和pH9~10（賴氨酸-酪氨酸滴定范圍）當(dāng)?shù)味ǖ鞍兹芤旱膒H低于3或高于10時可能就會引起亞基的解離。（2）強變性劑：大部分蛋白質(zhì)在尿素或鹽酸胍的濃溶液中發(fā)生變性而使亞基解離。7/22/202337二硫鍵的拆開：如果蛋白質(zhì)中的兩條肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^二硫鍵聯(lián)接，就需要較強的條件將二硫鍵切斷，拆開肽鏈。切斷二硫鍵主要采用氧化法和還原法。氧化法：常用的氧化劑為過氧甲酸，將二硫鍵的硫氧化為磺酸基。此法的優(yōu)點為二硫鍵拆開后，不能重新形成二硫鍵。缺點是在氧化二硫鍵的同時，將肽鏈中的蛋氨酸側(cè)鏈氧化為亞砜，色氨酸側(cè)鏈被破壞。還原法：常用的還原劑有二硫蘇糖醇（DTT）、巰基乙醇，巰基乙酸等，將二硫鍵還原為巰基。此法的優(yōu)點為條件溫和，不破壞肽鏈中的其它氨基酸。缺點為還原后的巰基還會重新形成二硫鍵，常用封閉基團(tuán)對拆開的三硫鍵進(jìn)行封閉而加以保護(hù)。7/22/2023387/22/2023397/22/202340氨基和酰胺基的測定：（1）氨基測定：使用2，4，6-三硝基苯磺酸鑒定蛋白質(zhì)和肽中游離氨基，方法比較靈敏。該試劑在溫和條件下與—NH2定量反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的三硝基苯衍生物。該試劑與組氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基等沒有反應(yīng)。氨基的三硝基苯衍生物可用分光光度法定量測定。（2）酰氨基的測定：首先將酰胺水解成氨，然后進(jìn)行測定。水解條件為濃鹽酸37℃水解10天或用2M鹽酸100℃水解2小時。最后，通過測定產(chǎn)生氨的量，測定酰胺的量。back7/22/202341肽鏈的部分裂解及肽片段的分離

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定，就目前的測定方法來看，只能測定小于50個氨基酸殘基的小片段，當(dāng)肽鏈長度超過50個氨基酸殘基后，測定的準(zhǔn)確性明顯降低。因此，在蛋白質(zhì)序列測定前，必須將蛋白質(zhì)裂解為一些小的片段，分別對小片段進(jìn)行測定，然后再將小片段拼接在一起而完成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定工作。7/22/202342肽鏈的部分裂解肽鏈的部分裂解化學(xué)裂解法酶解法專一性化學(xué)試劑法部分酸水解法7/22/202343溴化氰（CNBr）裂解：該方法是化學(xué)裂解方法中最好的方法。它與蛋白質(zhì)中的蛋氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)脂，進(jìn)一步與水反應(yīng)，將肽鍵斷裂。N端一側(cè)肽段的C端成為高絲氨酸內(nèi)脂，C端一側(cè)肽段的N端不變。7/22/2023447/22/2023457/22/2023467/22/2023477/22/202348部分酸水解法：F.Sanger早期研究胰島素的一級結(jié)構(gòu)時使用了稀酸部分水解的方法。部分酸水解法一般分稀酸和濃酸兩種條件。在稀酸的條件下，天冬氨酸后面的肽鍵容易斷裂，在pH2.5時水解相當(dāng)完全。在濃酸條件下，含羥基的側(cè)鏈殘基右側(cè)肽鍵容易斷裂。酸水解法雖然有一定的規(guī)律性，但其專一性仍不如其它方法。7/22/2023497/22/202350

用溴化氰裂解法可以得到一套裂解的肽段，通常得到的片段較大，這樣的大肽段不易直接測定氨基酸的排列順序，要進(jìn)行多次裂解，才能得到合適的測序片段。而且，測序時，將蛋白質(zhì)分解為小的片段，測定后再拼接成完整的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，拼接時，必須用多套肽段重疊比較才能得出其一級結(jié)構(gòu)。因此，測序前要有兩套以上的裂解肽段，才能完成蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定。7/22/202351蛋白酶的專一性：胰蛋白酶R1=Lys或Arg側(cè)鏈糜蛋白酶R1=Phe、Trp、Tyr側(cè)鏈胃蛋白酶R1=Phe、Trp、Tyr側(cè)鏈?zhǔn)葻峋鞍酌窻2=Leu、Ile、Val側(cè)鏈7/22/202352

在酶解法中，胰蛋白酶的專一性最強，只切斷以賴氨酸或精氨酸為C末端的肽段。肽鏈經(jīng)過胰酶裂解之后應(yīng)該得到n+1個肽段。N是賴氨酸和精氨酸的總數(shù)。若水解產(chǎn)生了游離的賴氨酸或精氨酸時，肽段數(shù)小于n+1。在典型的蛋白質(zhì)中，賴氨酸和精氨酸的總數(shù)約占10%，產(chǎn)生肽段的平均長為10個氨基酸殘基左右，非常適合順序測定。

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若將肽鏈進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，可擴大胰蛋白酶的使用范圍。如將賴氨酸的ε-氨基修飾后，胰酶專一性地水解肽鏈中精氨酸的部位；如果肽鏈中賴氨酸和精氨酸數(shù)量太少，可將半胱氨酸修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)橐让傅乃馕稽c。7/22/202354蛋白質(zhì)部分裂解后肽片段的分離

初分離：常用凝膠過濾法分離程序再分離：常用離子交換法提純：常用電泳、紙層析、薄層層析或電泳層析結(jié)合法7/22/2023557/22/202356初步分離的肽段，一般用離子交換柱層析法進(jìn)一步提純。較大的肽段一般用離子交換纖維素或離子交換葡聚糖凝膠。較小的肽片段多用離子交換樹脂（Dowex50、Dowex1等）洗脫方式一般用pH或鹽濃度梯度洗脫法。注意：肽段的分子量一般較小，脫鹽是很困難的。因此，洗脫時一般采用揮發(fā)性緩沖液。7/22/2023577/22/202358

經(jīng)過初步分離的水解片段尚需高壓電泳、紙層析或薄層層析進(jìn)一步提純。這些方法分離效果很好，只是得量很少。特別是一相用紙層析，一相用高壓電泳的方法，不僅可以用來分離肽段和鑒定肽段的純度，而且可以從水解得到的肽段混合物的層析-電泳圖譜（指紋圖）來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異。7/22/202359部分水解片段的序列測定序列測定常用方法異硫氰苯脂法（Edman降解法）DNS-Cl-Edman法酶解測序法蛋白質(zhì)順序測定儀7/22/202360異硫氰酸苯脂法，是蛋白質(zhì)序列測定中最常用的方法。首先，異硫氰酸苯脂與肽片段的N-末端反應(yīng)生成異硫氰酸苯脂氨基酰肽。與異硫氰酸苯脂結(jié)合的N-端氨基酸水解后以苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物釋出，同時釋放C-端完整肽鏈。C-端完整肽鏈可連續(xù)進(jìn)行測定，苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物經(jīng)提取后用于層析鑒定。本法在順利的情況下，可以確定十個或更多的氨基酸排列順序。7/22/202361

DNS-Cl-Edman法是DNS法和Edman法的有機結(jié)合。該法的最大優(yōu)點是靈敏度進(jìn)一步提高，一毫微克的樣品即可進(jìn)行測定。測定程序如下：（1）將微量樣品真空干燥，用水溶解后取出少量樣品用DNS法測N端氨基酸，確定N端第一個氨基酸；剩余的樣品進(jìn)行Edman降解后，再取少量樣品用DNS法測N端氨基酸，如此反復(fù)循環(huán)后，測出整條肽鏈的順序。7/22/2023627/22/202363酶解法測定順序：利用外肽酶（N-肽酶和C-肽酶）對蛋白質(zhì)從N-端或C-端進(jìn)行逐個氨基酸的水解，從氨基酸的釋放順序測定氨基酸的排列。此法在酶解時，往往在肽鏈的第一個氨基酸還沒有釋放完全時，第二個氨基酸已經(jīng)開始釋放，必須用氨基酸釋放時間與氨基酸釋放量的關(guān)系做圖，才能求出氨基酸在肽鏈中的順序。但有時也會出現(xiàn)第二個氨基酸釋放速度與第一個氨基酸釋放速度相同的現(xiàn)象，在這種情況下將不能用此法測定。7/22/202364到目前為止，沒有任何一種可以測定超過50個氨基酸殘基的方法。而且隨著肽鏈的延長，測定的準(zhǔn)確性會大大的降低。因此，都是將蛋白質(zhì)水解為小肽段，再測定小肽段的順序，最后將小肽段拼接為完整的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解后，產(chǎn)生了水解位點的n+1個水解片段。提純分離后，這些片段的位置被打亂，Sanger利用兩套水解片段重疊法，最終解決了這一難題。部分水解肽段的順序確定7/22/202365N-賴谷蘇丙丙丙賴苯谷精谷胺組蛋天