6第六章-外源化學物的一般毒性作用解讀課件

外源化學物的一般毒性作用

(commontoxicityofchemicalpoison)青大醫(yī)學院公共衛(wèi)生系王樹林7/23/20231第六章外源化學物的一般毒性作用第一節(jié)概述第二節(jié)急性毒性作用第三節(jié)局部毒性作用第四節(jié)短期、亞慢性和慢性毒性實驗7/23/20232第一節(jié)概述毒理學研究方法體外實驗(invitro)流行病學研究

(EpidemiologicalStudy)

體內(nèi)實驗(invivo)

整體動物實驗人體觀察

離體器官組織：

心、肝、肺、腎、腦細胞原代細胞、細胞株、細胞系細胞器：線粒體、微粒體等特殊毒性：致突變致畸致癌

臨床毒理學研究：中毒事故的處理或治療描述流行病學研究：提出病因假說分析流行病學研究：

驗證病因假說，明確因果關(guān)系基礎(chǔ)毒性：急性亞急性亞慢性慢性刺激性志愿者研究：低濃度、短時間、可逆性7/23/20233第一節(jié)概述毒理學研究方法分類：一、按染毒頻率分為：急性毒性實驗：24小時內(nèi)一次或多次染毒蓄積毒性實驗：多次重復染毒二、按染毒時間分為：急性毒性實驗：24小時內(nèi)一次或多次染毒亞急性毒性實驗：1~30天重復染毒（短期重復染毒實驗）亞慢性毒性實驗：1~3個月重復染毒慢性毒性實驗：3個月以上重復染毒7/23/20234第一節(jié)概述三、按整個實驗時間分為：短期毒性實驗：實驗數(shù)天至數(shù)周內(nèi)完成，如：誘變實驗中期毒性實驗：實驗數(shù)周至數(shù)月內(nèi)完成，如：特定靶器官的致癌實驗長期毒性實驗（終生毒性實驗）：數(shù)月至終生致癌實驗多代毒性實驗：實驗須經(jīng)歷一代、二代或三代。如：繁殖實驗7/23/20235第一節(jié)概述我國對農(nóng)藥、食品污染物、化妝品和消毒劑等化學物毒性試驗期限實驗農(nóng)藥食品污染物化妝品消毒劑亞急性1-4周短期亞慢性3-6周90天至少90天90天慢性大鼠18月同左至少6月6月-2年小鼠24月同左7/23/20236一般毒性實驗方法要點根據(jù)外源化學物種類的不同，急性毒性試驗的程序和要求有所不同。但總體原則和要點是相似的。主要包括：7/23/20237一般毒性實驗方法要點實驗動物：選擇（種屬、品系、清潔級別）性別、年齡、體重數(shù)量、分組飼養(yǎng)環(huán)境環(huán)境適應與檢疫禁食受試物：化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)環(huán)節(jié)質(zhì)控：批次、保管、分樣、稱重、配制劑型：水溶液、混懸液、油溶液（溶劑和助劑）材料7/23/20238一般毒性實驗方法要點染毒方法染毒劑量效應觀察觀察時間和周期觀察指標整體一般觀察中毒體征及發(fā)生過程（發(fā)生時間）死亡情況及時間分布體重變化取材病理檢查生化檢驗方法7/23/20239一般毒性實驗方法要點結(jié)果統(tǒng)計和描述中毒體征和時間關(guān)系死亡情況與時間關(guān)系劑量（反應）效應關(guān)系生化檢驗結(jié)果的統(tǒng)計病理檢查結(jié)果的描述分析討論和評定分析討論實驗結(jié)果形成的原因分析討論實驗結(jié)果所揭示的問題對實驗的評定對毒物的評定討論結(jié)果7/23/202310一、實驗動物

（1、選擇原則）實驗動物的選擇原則：盡量選擇急性毒性反應與人近似的動物（種屬）品系（如SD、Wistar大鼠等）純化、適宜清潔級別（影響因素易控）易于飼養(yǎng)，試驗動物操作方便

繁殖生育力較強，數(shù)量較大能夠保障供應

價格較低，易于獲得動物常用實驗動物為大白鼠和小白鼠7/23/202311一、實驗動物

（2、性別、年齡、體重）性別動物應當是雌、雄各半

如果在研究中發(fā)現(xiàn)待測化學物對雌、雄動物的毒性大小有明顯差異時，應分別求出雌性與雄性動物各自的LD50值如果試驗是為致畸試驗作劑量準備，也可僅做雌性動物的LD50試驗7/23/202312年齡急性毒性試驗選用的實驗動物年齡通常要求初成年的動物，且為健康未交配和受孕的動物；亞慢性要求性剛成熟，慢性要求初斷乳。體重同一次試驗同一批實驗動物體重變異范圍不應超過該批動物平均體重的20％。一、實驗動物

（2、性別、年齡、體重）7/23/202313動物種類生活年限(年)成年體重選擇范圍(g)時間(月)體重(g)急性實驗慢性實驗小鼠1.5~221518~2510~15大鼠2~2.53150150~25050~100豚鼠6~83250200~250150~200兔4~93~415001500~20001200~1500貓10~123~415001500~25001000~1500狗15~203~4100008000~15000400~8000實驗動物的生活年限及體重選擇一、實驗動物

（2、性別、年齡、體重）7/23/202314一、實驗動物

（3、數(shù)量、分組）數(shù)量在利用不同的方法測定化學物LD50時，實驗設計中對動物數(shù)的要求不同霍恩氏法測LD50時要求有4個劑量組，每組4或5只動物概率單位法、Bliss法測定則要求5—7個劑量組，每組10只動物或10只以上對于不同的化學物測定應根據(jù)其相應的試驗規(guī)程確定實驗動物數(shù)量7/23/202315一、實驗動物

（3、數(shù)量、分組）分組：均衡性和隨機性均衡性：要求各組動物的平均體重及體重的離散度盡可能一致。具體來說是（1）實驗動物的體重不應超過全體實驗動物平均體重的20％---控制離散度（2）每組之間的平均體重相差不應超過10％---控制均衡性隨機性：每只動物分散到各組去的機會是均等的，以避免成見或系統(tǒng)誤差7/23/202316一、實驗動物

（4、飼養(yǎng)環(huán)境）實驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境（無特殊環(huán)境要求時）應具有適宜性、清潔性、恒定性。小氣候：溫度(22±3℃)、濕度(30~70%)、通風、照明(晝夜各半)等。籠具墊料飲水飼料7/23/202317一、實驗動物

（5、環(huán)境適應與檢疫）在選擇和購買實驗動物后，應先進行動物的染毒前環(huán)境適應和檢疫觀察。環(huán)境適應：讓外購來的實驗動物在本試驗室條件下適應一段時間，減少環(huán)境和生理條件變化可能對試驗結(jié)果的影響；篩檢健康、體重等不符合試驗要求的動物。在檢疫期內(nèi)出現(xiàn)臨床異常者應予放棄，不可用于試驗。檢疫期內(nèi)雌雄必須注意分籠飼養(yǎng)，防止交配和受孕。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的檢疫期為1周，犬、猴等適當?shù)匮娱L至2~3周。7/23/202318一、實驗動物

（6、禁食）禁食采用經(jīng)口途徑染毒，實驗動物胃腸道內(nèi)食物存留量對化學毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾，因此在試驗給藥前應作禁食處理。禁食時間：大鼠主要在夜間進食，所以要求染毒前應隔夜禁食。小鼠和大鼠基本類似，但由于其消化吸收和代謝速度較快，可隔夜禁食也可禁食4小時以上。大動物常在上午染毒，前一天正常給食，染毒前不喂食即可。禁食期間均正常給予飲水。染毒2小時后提供飼料。經(jīng)口多次染毒，可不禁食。7/23/202319二、受試物處理受試物時應了解：受試物的純度及雜質(zhì)成分；化學結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)：揮發(fā)性（熔點/沸點）、溶解性、PH、穩(wěn)定性?；瘜W結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似化合物的毒性資料。7/23/202320二、受試物受試物要求：分析純同一種、同一批號成分和配方固定（如為異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定）一次備齊所需受試物總量=(A×B×C×D)×1.2A為每組動物數(shù)；B為各處理組的劑量和；C為染毒次數(shù)（通常為天）；D為動物的平均體重；1.2為安全因子，包含損耗量。7/23/202321二、受試物處理受試物時每個環(huán)節(jié)都應質(zhì)控批次運輸保管分樣稱重配制貯存7/23/202322二、受試物常用劑型：水溶液、油溶液和混懸液。處理受試物時，所選溶劑或助劑的要求是：無毒、無特殊刺激性和氣味；不與受試物發(fā)生反應，受試物在溶劑或助劑中穩(wěn)定；不影響受試物的毒性（毒動學和毒效學）；受試物在溶劑或助劑中穩(wěn)定。7/23/202323三、染毒途徑一般毒性試驗染毒途徑(exposureroutes)的選擇應考慮幾方面因素：模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸該受試物的途徑和方式；有利于不同化學物之間急性毒性大小的比較；受試物的性質(zhì)和用途；各種受試物毒性評價程序的要求等。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。7/23/202324三、染毒途徑

（1、經(jīng)口染毒）經(jīng)口（胃腸道）染毒(oralexposure)經(jīng)口途徑：可分為灌胃、喂飼、吞咽膠囊等方式。經(jīng)口灌胃染毒是急性毒性試驗中最常用的染毒途徑。一般來說新的化學物均先進行經(jīng)口染毒途徑的急性毒性試驗，求出LD50值。通常以經(jīng)口途徑的LD50值來比較不同化學物急性毒性大小。7/23/202325三、染毒途徑

（1、經(jīng)口染毒）灌胃：空腹灌胃后2-3h復食灌胃的體積不超過體重的1-2％：小鼠為0.2~1.0ml/只或0.1~0.5ml/10g較合適；大鼠為5ml/只(通常用0.5~1.0ml/100g）；家兔為10ml/2kg體重；狗不超過50ml/10kg7/23/202326三、染毒途徑

（2、經(jīng)呼吸道)經(jīng)呼吸道染毒在常溫、常壓下為氣態(tài)，或在生產(chǎn)過程中和生活過程中以蒸氣、氣溶膠、煙、粉塵狀態(tài)污染生產(chǎn)與生活環(huán)境空氣，此時就有可能經(jīng)呼吸道吸入吸入接觸分為兩種方式靜式吸入動式吸入7/23/202327三、染毒途徑

（3、經(jīng)皮膚）經(jīng)皮膚染毒研究外源化學物經(jīng)皮膚吸收應當盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象，目前多選用家兔和豚鼠。但由于研究化學物經(jīng)皮膚吸收的毒性(求經(jīng)皮LD50)所需的實驗動物較多，使用家兔、豚鼠不夠經(jīng)濟，也常用大鼠代替。7/23/202328三、染毒途徑

（3、經(jīng)皮膚）經(jīng)皮膚染毒程序給予受試物前24h，確定受試部位機械或化學脫毛面積10%～15%體表面積檢查去毛部位有無異?，F(xiàn)象單位體重相同容積染毒接觸時間與人實際接觸該化學物的時間相仿7/23/202329三、染毒途徑

（4、注射）注射途徑可分為靜脈注射或滴注、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、椎管內(nèi)注射等。使用注射途徑染毒時需注意控制注射量、注射速度。應調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH一般應為5~8，用等滲溶液。毒物代謝動力學研究，注射藥品毒性7/23/202330三、染毒途徑

（4、注射）注射方式小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2~1.01~32~55~105~15肌肉0.1~0.20.2~0.50.2~0.50.5~12~5靜脈0.2~0.51~21~53~105~15皮下0.1~0.50.5~10.5~21~33~10常用實驗動物給于受試物的體積（ml）7/23/202331四、染毒劑量染毒劑量的確定劑量選擇是一般毒性試驗成功的基礎(chǔ)。首先了解分析受試化學物的化學結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，查閱文獻，找出毒性資料，并以前期研究得到的毒性參數(shù)為基礎(chǔ)設計。做預試驗。每個劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化學物的致死劑量范圍。7/23/202332五、效應觀察

（1、觀察時間和周期）觀察時間和周期測定外源化學物的LD50(LC50)，一般要求計算實驗動物接觸化學物之后兩周（14天）內(nèi)的總死亡數(shù)對于一些速死性化學物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率有些速死性化學物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別但應注明是多少時間的LD50值，以便于在進行毒性比較時有共同的基礎(chǔ)7/23/202333五、效應觀察

（2、整體毒效應觀察）中毒體征及發(fā)生過程（發(fā)生時間）實驗動物的毒性表現(xiàn)有一些規(guī)律，許多毒物染毒后，往往出現(xiàn)：興奮→抑制→死亡。含有氰基（－CN）的氫氰酸和丙烯腈對大鼠和小鼠染毒抑制→死亡。N–苯甲?；?（3，4–二氯苯基）-2–氨基–丙酸乙酯，一般性的中毒表現(xiàn)，很快恢復，數(shù)日內(nèi)均“安然無恙”，近一周后才逐漸表現(xiàn)為抑制、拒食、消瘦、衰弱，昏迷直至死亡。二磷酸鹽類藥物7/23/202334五、效應觀察

（2、整體毒效應觀察）死亡情況及時間分布：計算LD50

體重變化：有助于了解受試化學物所致的中毒效應是短暫的或較長期的效應體重可以反映動物中毒后的整體變化體重改變的原因很多，若化學毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗動物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕。若化學毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會減輕。如果化學毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來。7/23/202335五、效應觀察

（3、病理檢查和生化檢驗）病理檢查凡中毒死亡動物應及時解剖做病理學檢查，檢查器官有無充血、出血、水腫或其它改變，并對有變化的臟器作病理組織學檢查對存活動物于觀察期結(jié)束后應做病理學檢查生化檢驗7/23/202336五、效應觀察

（4、標本檢測原則）1、首先估算每只動物檢測樣本的量（如，采血量、肝臟、脾臟、腎臟重量）2、估算各檢測項目需檢測標本的量，是否能滿足全部設計的檢測項目。3、首先應滿足接觸標志物和效應標志物，其次能反映靶標和有助于機制探索的檢測項目。7/23/202337第二節(jié)急性毒性作用

(acutetoxicitytest)急性毒性概念急性實驗目的急性毒性實驗方法要點急性毒性分級和評價7/23/202338概述—急性毒性實驗（一）急性毒性概念

急性毒性(acutetoxicity)：是指機體(人或?qū)嶒瀯游?一次或24小時內(nèi)多次接觸外源化學物后在短期內(nèi)(一般到14天)所產(chǎn)生的毒性效應。包括一般行為、外觀改變、大體改變及死亡效應，最主要觀察指標是LD50。7/23/202339概述—急性毒性實驗（二）注意事項（1.染毒次數(shù)與時間）實驗動物接觸化學物的方式或途徑不同，“一次”的含義也有所不同：經(jīng)口和注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化學物輸入實驗動物體內(nèi)經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個特定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化學物的過程所以“一次”含有時間因素7/23/202340概述—急性毒性實驗（二）注意事項（1.染毒次數(shù)與時間）“24小時多次”的概念是指當外源化學物毒性很低，一次最大染毒給予實驗動物后還不能達到充分了解該毒物急性毒性作用的目的，從而在24小時內(nèi)分次染毒，即為“多次”。國內(nèi)一般規(guī)定為24小時內(nèi)不超過3次。7/23/202341概述—急性毒性實驗（二）注意事項（2.毒效應出現(xiàn)時間）不能僅以接觸毒物后毒性癥狀出現(xiàn)的時間來判定該毒物的某種毒性效應是否屬于急性毒性，因為：有的化學毒物在實驗動物接觸數(shù)分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生嚴重中毒癥狀，甚至瞬間死亡；而有些化學毒物幾天、十幾天后動物才產(chǎn)生明顯的中毒癥狀和死亡，呈現(xiàn)遲發(fā)毒效應和死亡。有的化學毒物在出現(xiàn)快速和劇烈的毒效應后很快恢復；有的化學物早期僅有較輕微癥狀，很快恢復，但在幾天后又出現(xiàn)嚴重中毒癥狀甚至死亡。7/23/202342概述—急性毒性實驗（二）注意事項（2.毒效應出現(xiàn)時間）一般急性大劑量染毒可引起速發(fā)毒性也能引起遲發(fā)毒性，可能產(chǎn)生也可能不產(chǎn)生與重復染毒類似的毒性。應主要以接觸毒物的時間，規(guī)定的“一次或24小時內(nèi)多次接觸”后所產(chǎn)生的毒性效應。觀察急性毒效應一般為14天，如有必要可延長至14天以上。7/23/202343概述—急性毒性實驗（二）注意事項（3.毒效應強度）急性毒性與亞慢性、慢性中毒相比其癥狀常常是很劇烈的，機體急性一次性大劑量接觸毒物后所表現(xiàn)出的一般行為，外觀、大體形態(tài)的改變十分明顯，中毒癥狀嚴重，常常發(fā)生死亡。急性毒性常常以死亡為觀察重點和觀察終點。7/23/202344概述—急性毒性實驗各個劑量組的確定急性毒性試驗除設立幾個劑量組外，是否設正常和溶劑對照組，有不同意見。但在實際工作中，除有特殊規(guī)定外，均不設立對照組。劑量組數(shù)需根據(jù)試驗設計所選用的LD50計算方法來確定。如寇氏法、Bliss法一般設5~8個劑量組；霍恩氏法設4個劑量組。利用外源化學物LD50時設置劑量組，應依預試驗結(jié)果而定一般設置5~7個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠6~8只、家兔4~6只7/23/202345概述—急性毒性實驗經(jīng)典急性毒性劑量確定與分組陰性對照組低劑量組(毒性作用明顯，但沒有或僅有個別動物死亡，相當于LD0)中劑量組(毒性作用明顯，有50%動物死亡，相當于LD50)高劑量組(介于LD50-LD95之間)溶劑對照組陽性對照7/23/202346概述—急性毒性實驗（三）急性實驗目的1.測試和求出毒物的致死劑量以及其他急性毒性參數(shù)，通常以LD50（半數(shù)致死劑量）為最主要的參數(shù)，并根據(jù)LD50值進行急性毒性分級。2.通過觀察動物中毒表現(xiàn)、毒作用強度和死亡情況，初步評價毒物對機體的毒效應特征、靶器官、劑量－反應（效應）關(guān)系和對人體產(chǎn)生損害的危險性。3.為亞慢性、慢性毒性試驗研究以及其他毒理試驗提供接觸劑量和觀察指標選擇的依據(jù)。4.為毒理學機理研究提供線索。7/23/202347概述—急性毒性實驗（四）急性毒性實驗應用：了解外源化學物對機體產(chǎn)生急性毒性的主要依據(jù)，是毒理學研究中最基礎(chǔ)的工作。對于和人類生活密切接觸的化學物如新的食品、藥品、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)毒物等毒理學安全性評價，通常是必做的試驗。是評估毒性大小的第一步工作。7/23/202348概述—急性毒性實驗（五）急性毒性實驗分類1.經(jīng)典急性毒性實驗：以死亡為其觀察終點，所需實驗動物數(shù)量多。概率單位法改進寇氏法霍恩法（Horn）7/23/202349概述—急性毒性實驗經(jīng)典急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學、血液學及其它化驗檢查所提供的深入細致的毒性信息。7/23/202350概述—急性毒性實驗2.急性毒性替代實驗：減少了實驗動物數(shù)量；優(yōu)化了動物實驗。向3R方向發(fā)展。1）固定劑量法(fixeddoseprocedure)：不以死亡為觀察終點；固定劑量。利用預先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學物的毒性反應來對化學無毒性進行分級。7/23/202351概述—急性毒性實驗2.急性毒性替代實驗：2）急性毒性分級法(acutetoxicclassmethod)：以死亡為觀察終點；分階段實驗。每階段3只動物，根據(jù)死亡動物數(shù)，判定毒性。3）上-下移動法(up/downmethod)或階梯法：多種觀察終點；初步資料第一只動物劑量毒性反應第二只動物劑量·······7/23/202352急性毒性分級和評價我國或國際上的急性毒性分級標準均還存在不少缺點，因為它們主要是根據(jù)經(jīng)驗確定，客觀性還不足。目前還沒有全世界公認、統(tǒng)一的毒性分級標準。急性毒性試驗求出LD50(LC50)值，通過LD50值進行急性毒性分級(acutetoxicityclassification)，評價毒物的急性毒性的強弱，比較毒物的急性毒性大小。應注意急性毒性試驗結(jié)束時，除報告該毒物的LD50值和急性毒性級別外，還應對中毒和死亡特征加以報告。7/23/202353急性毒性分級和評價在毒理學中為什么選用LD50作為判斷化合物急性毒性的分級指標？LD50是通過對各試驗組的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析得來的，其作為判斷化合物急性毒性的分級指標的原因是：LD50代表受試群體感受性的平均情況，因而代表性好。位于劑量反應關(guān)系S形曲線中央，LD50不受兩端個別動物感受性特高或特低的影響。此處曲線的坡度最大，因而LD50靈敏性高。其附近的曲線近似直線，因而LD50穩(wěn)定性好。死亡比非死亡的許多效應便于準確觀察。7/23/202354急性毒性分級和評價外源化學物急性毒性分級（WHO）毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時，死亡2~4只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(/mg/kg)對人可能致死的估計量g/kg總量(g/60kg)劇毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250實際無毒5000~10000~2180~>15>10007/23/202355急性毒性分級和評價我國食品毒理急性毒性分級法(1994)急性毒性分級大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)大致相當于70kg人的致死量6級(極毒)<1稍嘗,<7滴5級(劇毒)1~507滴~1茶匙4級(中等毒)51~5001茶匙~35克3級(低毒)501~500035~350克2級(實際無毒)5001~15000350~1050克1級(無毒)>15000>1050克7/23/202356第三節(jié)局部刺激實驗局部刺激實驗目的是了解外源化學物對眼睛和皮膚的局部刺激作用和腐蝕作用。包括眼刺激實驗、皮膚刺激和致敏實驗。我國農(nóng)藥、化學品和消毒劑毒理學實驗程序均規(guī)定局部刺激實驗為必做項目。7/23/202357Draize實驗由FDAJohnDraize于1944年建立。作為眼刺激和皮膚刺激鑒定實驗。局限性：實驗評分主觀性強；結(jié)果重復性差；種屬差異。7/23/202358眼刺激實驗一、概述眼睛刺激性(EyeIrritation)：指眼球表面接觸受試樣品后產(chǎn)生的可逆性炎性變化。眼睛腐蝕性(EyeCorrosion)：指眼球表面接觸受試樣品后引起的不可逆性組織損傷。7/23/202359眼刺激實驗二、試驗基本原則受試樣品以一次劑量滴入每只實驗動物的一側(cè)眼睛結(jié)膜囊內(nèi)，以未作處理的另一側(cè)眼睛作為自身對照；在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評分，以此評價受試樣品對眼睛的刺激作用。觀察時間應能足以評價刺激效應的可逆性和不可逆性。觀察時間最少72h，一般7d，但一般不超過21d；當動物出現(xiàn)嚴重和持久的痛苦跡象時，以適當?shù)姆绞綄游锾幩溃?/23/202360眼刺激實驗三、實驗動物及動物數(shù)量首選家兔。一般4只。如果受試樣品的顯著效應是可預見的，可以考慮用一只動物。如果用一只動物試驗得出的結(jié)果提示受試樣品有嚴重的刺激性和腐蝕性，則不必進行進一步的試驗。如果結(jié)果相反，則至少需要3只家兔。有時，在增加動物的進一步試驗中應該適當?shù)年U明可疑反應。7/23/202361眼刺激實驗四、不適宜做眼刺激實驗的情況：強酸或強堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于其可預見的腐蝕特性，不必做本試驗；已在皮膚試驗中證實具有腐蝕或嚴重刺激毒性的物質(zhì)不必進行眼刺激試驗，可以推測該物質(zhì)對眼睛將會引起相似的嚴重結(jié)果；在充分并公認的體外試驗結(jié)果中確定可能產(chǎn)生刺激性或腐蝕性的物質(zhì)不必進行體內(nèi)試驗。7/23/202362眼刺激實驗五、結(jié)果急性眼刺激試驗結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結(jié)果，則會增加從動物外推到人的可靠性。7/23/202363皮膚刺激實驗一、概述皮膚刺激性(DermalIrritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性(DermalCorrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。7/23/202364皮膚刺激實驗二、試驗基本原則和要求1、將受試樣品一次（或多次）涂（敷）于健康無破損的皮膚上，并作自身對照（除非懷疑有嚴重的刺激/腐蝕并逐漸發(fā)展）；2、在規(guī)定時間間隔內(nèi)觀察和評價刺激反應的程度，并作詳細的記錄。3、試驗前24h，將實驗動物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無損的動物進行試驗。不應在長有濃密島狀毛的部位進行受試樣品試驗。7/23/202365皮膚刺激實驗二、試驗基本原則4、取受試樣品直接涂布在皮膚上，用二層紗布和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對照。采用封閉試驗，敷用時間為4h。試驗結(jié)束后，用溫水或無刺激性溶劑清除殘留受試樣品。5、觀察時間的確定應足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過程，以便進行完整的評價，一般不超過14d。7/23/202366皮膚刺激實驗三、實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。如果使用其他的哺乳動物做試驗，試驗者應提供選擇的依據(jù)。至少需要4只健康成年動物（雄性和/或雌性均可），每只動物相鄰的未處理的皮膚可作為對照。實驗動物應單籠飼養(yǎng)，試驗前動物要在動物實驗室中至少適應3d時間。實驗動物和動物實驗室應符合國家相應規(guī)定。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。7/23/202367皮膚刺激實驗四、不適宜做皮膚刺激實驗的情況：強酸或強堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于可預見其腐蝕特性，不必做本試驗；在充分并公認的體外試驗結(jié)果中確定可能產(chǎn)生腐蝕或刺激毒性的物質(zhì)不必進行體內(nèi)試驗。如果從受試樣品的結(jié)構(gòu)活性構(gòu)效關(guān)系可以預見潛在的腐蝕毒性，則不必做本試驗。若已知受試樣品有很強的經(jīng)皮吸收毒性（LD50≤200mg/kgbw）的物質(zhì)（系統(tǒng)毒性）不必進行本試驗；在急性經(jīng)皮毒性試驗中染毒劑量達2000mg/kgbw時仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)。7/23/202368皮膚刺激實驗五、結(jié)果急性皮膚刺激試驗結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結(jié)果，則會增加從動物外推到人的可靠性。試驗中使用封閉式接觸是一種超常的實驗室條件下的試驗，在人類實際接觸化學品過程中很少存在這種接觸方式。7/23/202369眼和皮膚刺激試驗的替代一、離體細胞、組織器官模型指利用廢棄的離體動物眼球、角膜作為眼刺激試驗材料替代整體動物的試驗。目前開展的主要有離體雞眼試驗(chickenenucleatedeyetest,CEET)、離體兔眼試驗(isolatedrabbiteyetest,IRE)、牛角膜混濁與滲透力(bovinecornealopacityandpermeability,BCOP)影響試驗體外細胞培養(yǎng)：人角朊細胞,以避免不同種屬之間結(jié)果外推的不確定性。皮膚成纖維細胞培養(yǎng)皮膚組織培養(yǎng)7/23/202370眼和皮膚刺激試驗的替代二、絨毛膜尿囊膜(chorioallantoicmembrane,CAM)試驗

絨毛膜尿囊膜是雞胚外的循環(huán)系統(tǒng),與眼結(jié)膜組織結(jié)構(gòu)相似，是眼刺激性試驗替代方法中廣泛使用的模型之一。目前研究的主要有雞胚絨毛膜尿囊膜(hen’segg2chorioallantoicmembrane,HET2CAM)試驗、絨毛膜尿囊膜-臺盼藍染色(chorioallantoicmembrane-trypanbluestraining,CAM-TBS)試驗絨毛膜尿囊膜血管試驗(chorioallantoicmembranevas-cularassay,CAMVA)。7/23/202371皮膚致敏實驗一、概述皮膚致敏反應/過敏性接觸性皮炎(SkinSensitization/AllergicContactDermatitis)：是皮膚對一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應。對于人類這種反應可能以搔癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反應不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。7/23/202372皮膚致敏實驗二、試驗基本原則1、誘導接觸(InductionExposure)：指機體通過接觸受試樣品以達到誘導產(chǎn)生致敏狀態(tài)目的的試驗性暴露；誘導期(InductionPeriod)：指機體通過接觸受試樣品而誘導出過敏狀態(tài)所需的時間；2、激發(fā)接觸(ChallengeExposure)：機體接受誘導暴露后，再次接觸受試樣品的試驗性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反應。7/23/202373皮膚致敏實驗二、試驗基本原則3、實驗動物通過多次皮膚涂抹誘導接觸受試樣品10～14d（誘導期）后，給予激發(fā)劑量的受試樣品，觀察實驗動物，并與對照動物比較對激發(fā)接觸受試樣品的皮膚反應強度。7/23/202374皮膚致敏實驗三、實驗動和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康、成年的白色豚鼠，體重250～300g。如選擇其它種屬，試驗者需提供選擇的依據(jù)。7/23/202375第四節(jié)短期、亞慢性和慢性毒性實驗（一）基本概念蓄積作用(accumulation)：當化學物與機體發(fā)生亞慢性接觸，將反復進入機體，而且當進入的速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時，化學物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留的現(xiàn)象7/23/202376短期、亞慢性和慢性毒性實驗蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)

一種外源化學物有無蓄積作用是評定該化學物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標準時安全系數(shù)的一種依據(jù)。7/23/202377短期、亞慢性和慢性毒性實驗物質(zhì)蓄積(materialaccumulation)：實驗動物反復多次接觸化學物后，用化學分析方法能夠測得機體內(nèi)存在該化學物或其代謝產(chǎn)物。功能蓄積(functionalaccumulation)：有的化學物在長期接觸后，機體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。7/23/202378短期、亞慢性和慢性毒性實驗功能蓄積可能是

由于貯存體內(nèi)的化學物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢出物質(zhì)的蓄積?；蛘呤怯捎诿看螜C體接觸化學物之后所引起的損害累積所致。7/23/202379短期、亞慢性和慢性毒性實驗（二）、概念短期（重復劑量）毒性：是指實驗動物或人連續(xù)接觸外源化學物14~30天所產(chǎn)生的中毒效應。亞慢性毒性(subchronictoxicity)：是指實驗動物或人連續(xù)較長期接觸外源化合物所產(chǎn)生的中毒效應。1~3個月。慢性毒性作用(chronictoxicity)：是指實驗動物或人長期（甚至終生）反復接觸外源化學物所產(chǎn)生的毒性效應。3個月以上。7/23/202380短期、亞慢性和慢性毒性實驗研究目的1.觀察長期接觸受試物的毒性效應譜，毒作用特點和毒作用的靶器官。了解其毒性機制。2.觀察長期接觸受試物毒性作用的可逆性.3.研究重復接觸受試物毒性作用的劑量一反應（效應）關(guān)系，從初步了解到確定未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)和觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)，為對該受試物的危險性評價和制定安全限量提供參考值。4.確定不同動物對受試物的毒效應差異，為將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)7/23/202381短期、亞慢性和慢性毒性實驗二、研究方法（一）實驗設計實驗動物受試物染毒方法和染毒期限染毒劑量和分組效應觀察結(jié)果統(tǒng)計和描述討論和評價（二）長期毒性實驗的注意事項7/23/202382短期、亞慢性和慢性毒性實驗（三）、結(jié)果評價：應全面、綜合、科學分析1.劑量相關(guān)趨勢2.反應重現(xiàn)性3.相關(guān)指標變化4.性別差異5.差異大小6.歷史性對照作用7/23/202383ThankYou！Theend！7/23/202384重復染毒毒性實驗

—實驗動物實驗動物的選擇重復染毒毒性實驗動物選擇原則與急性毒性實驗動物的選擇原則相似：與人接近；品系純化；易于飼養(yǎng)；便于操作；保障供應；易于獲得。與急性毒性實驗動物的主要區(qū)別在于：年齡（體重）和數(shù)量7/23/202385重復染毒毒性實驗

—實驗動物實驗動物的選擇亞慢性毒性實驗一般要求選擇兩種實驗動物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類，如大鼠和狗，以便全面了解受試物的毒性特征。慢性毒性試驗選擇實驗動物的條件與亞慢性毒性試驗相同。但實驗動物最好為純系甚至同窩動物均勻分布于各劑量組。7/23/202386重復染毒毒性實驗

—實驗動物

亞慢性毒性試驗

年齡：大鼠80~100g狗8~12月小鼠10~15g數(shù)量：小動物≥20

大動物≥6性別：雌雄各半

慢性毒性試驗年齡：大鼠初斷乳(出生后3~4周);50~70g小鼠初斷乳(出生后3周);10~12g狗<8月數(shù)量：小動物≥40大動物≥8性別：雌雄各半亞慢性、慢性毒性試驗實驗動物年齡應較?。粩?shù)量應較大。7/23/202387重復染毒毒性實驗

—染毒途徑亞慢性毒性試驗接觸外源化學物途徑的選擇，應考慮兩點：1.盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式2.應與預期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致具體接觸途徑主要有經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種7/23/202388重復染毒毒性實驗

—染毒途徑慢性毒性試驗多為經(jīng)口與經(jīng)呼吸道接觸染毒途徑經(jīng)口染毒小動物常采用灌胃法，大動物常采用灌胃法和膠囊法。經(jīng)呼吸道接觸，每日接觸時間，依試驗要求而定間歇性吸入適于工業(yè)毒物，每日吸入6～8小時連續(xù)性吸入適于環(huán)境污染物，全天性吸入。7/23/202389重復染毒毒性實驗

—染毒期限慢性毒性試驗期限一般認為工業(yè)毒理學慢性試驗動物染毒6個月或更長時間環(huán)境毒理學與食品毒理學則要求實驗動物染毒1年以上或2年也有學者主張動物終生接觸外源化學物才能全面反映外源化學物的慢性毒性效應，以及求出閾劑量或無作用劑量7/23/202390重復染毒毒性實驗

—染毒期限7/23/202391重復染毒毒性實驗—

劑量選擇與分組亞慢性、慢性實驗的劑量選擇的依據(jù)：一、急性、短期毒性實驗資料為依據(jù)。劑量選擇的一般步驟：急性毒性試驗亞急性毒性試驗（28天）亞慢性毒性試驗（90天）慢性毒性試驗7/23/202392重復染毒毒性實驗—

劑量選擇與分組亞慢性一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物LD50的1/20~1/5為最高劑量。亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。7/23/202393重復染毒毒性實驗—

劑量選擇與分組慢性一是以亞慢性閾劑量或其1/5~1/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/50~1/10為慢性毒性試驗的預計閾劑量組，并以其1/100為預計的慢性無作用劑量組一是以急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50的1/10、1/100和1/1000為染毒劑量7/23/202394重復染毒毒性實驗—

劑量選擇與分組亞慢性、慢性實驗的劑量選擇的依據(jù)：二、人群主動攝入（食品和藥品）的最高劑量為依據(jù)。大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30和100倍，非嚙齒類可用5、15、50倍。當預期受試物沒有明顯毒性時，亞慢性和慢性實驗設計至少等于人擬用劑量的最大倍數(shù)，保健食品為100倍，化學藥品為30倍，中藥為