沉淀反應(yīng)課件1

沉淀反應(yīng)（precipitationreaction)1編輯版ppt可溶性抗原+相應(yīng)抗體→肉眼可見的沉淀一、定義：凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)抗原性質(zhì)顆粒性抗原/可溶性抗原致敏顆?？扇苄钥乖磻?yīng)時間幾分鐘至十幾分鐘數(shù)小時至數(shù)天反應(yīng)產(chǎn)物凝集塊沉淀物稀釋物稀釋抗體稀釋抗原2編輯版ppt形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。沉淀線(環(huán))的觀察以及免疫比濁法中的終點法就是測定此階段形成的復(fù)合物

第一階段第二階段二、沉淀反應(yīng)分兩個階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定免疫復(fù)合物形成的速率。3編輯版ppt1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)液（毒素）與相應(yīng)抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應(yīng)可在凝膠中進(jìn)行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術(shù)1965年Mancini提出單向免疫擴散技術(shù)，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展1959年Schultze建立透射比濁法1967年Ritchie建立散射比濁法1977年Sternberg建立速率散射比濁法

發(fā)展趨勢：快速、微量、自動化。三、發(fā)展史：4編輯版ppt液體內(nèi)沉淀試驗?zāi)z內(nèi)沉淀試驗?zāi)z免疫電泳技術(shù)沉淀反應(yīng)可分三類免疫濁度測定絮狀沉淀試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗對流免疫電泳火箭免疫電泳免疫固定電泳5編輯版ppt

第一節(jié)液相內(nèi)沉淀試驗一、絮狀沉淀試驗:(flocculationtest)二、環(huán)狀沉淀試驗:(ringprecipitationtest)三、免疫濁度試驗:(immunoturbidimetry)6編輯版ppt

原理

一、絮狀沉淀試驗(flocculationtest)方法評價：

敏感度較低、簡便、易受抗原抗體比例影響最適比臨床意義：

測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。37℃抗原抗體康氏試驗：梅毒抗體7編輯版ppt康氏試驗康氏試驗是又稱非特異類脂質(zhì)抗原試驗,可用于梅毒篩查。原理:使用酒精浸泡牛心粉，提取磷脂部分做為抗原，加入膽固醇以增加靈敏度，與待測血清中抗體(反應(yīng)素)，在電解質(zhì)作用下，抗原抗體形成可見的沉淀反應(yīng)。請問目前常用的梅毒篩查有哪些方法?梅毒感染的確證實驗有哪些?8編輯版ppt抗原稀示意圖釋1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖

絮狀沉淀試驗AgAbAg9編輯版ppt抗體稀釋度抗原稀釋度1／101／201／401／801／1601／3201／640對照1／5+++++++++++++／--1／10+++++++++++++-1／20+++++++++++++-1／40-+／-+++++++++-1／80----+++-方陣滴定法10編輯版ppt

原理

二、環(huán)狀沉淀試驗(ringprecipitationtest)方法評價：

敏感度較低、簡便、快速、實用、只能定性不能定量、缺乏多對分辨力。臨床意義：

鑒定血跡、診斷炭疽AbAg沉淀管內(nèi)徑1.5～2mm陽性：1～5min出現(xiàn)沉淀環(huán)陰性：30min不出現(xiàn)沉淀環(huán)11編輯版ppt

三、免疫濁度試驗1.透射比濁法（transmissionturbidimetry)2.免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)3.散射比濁法（nephelometry)

①速率散射比濁法(ratenephelometry)

②終點散射比濁法(endpointnephelometry)返回12編輯版ppt海德堡進(jìn)行的沉淀分析

1、在抗體濃度過量時，隨著抗原濃度不斷上升免疫沉淀逐漸增多（如右圖）原理：抗原抗原抗體復(fù)合物13編輯版ppt檢測器檢測器透射測定散射比濁

2.抗原抗體復(fù)合物，在一定光線照射下，可產(chǎn)生散射光及透射光，并用儀器檢測這些光的強度，可反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物的量。原理：14編輯版pptI0入射光

透射光I吸光度A=lgI0/I＝k1bC復(fù)合物Ag-Ab復(fù)合物1.原理：一）透射比濁法C復(fù)合物＝k2C抗原（Ab過量）吸光度A

＝k3C抗原足夠大（35-100nm），要形成一定濁度15編輯版ppt稀釋待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品（5ul)ApoB抗血清1m(過量)（1∶32～1∶64）孵育一定時間測定吸光度(A340nm)值A(chǔ)吸光度抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線2.技術(shù)要點（載脂蛋白B的檢測）按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線16編輯版ppt4.方法評價：

操作簡單、快速、易于自動化；敏感度比單擴高10倍，但比散射比濁低（數(shù)量多而大的抗原抗體復(fù)合物才適用本方法）；反應(yīng)時間長(測定的是第二反應(yīng)階段)；抗體用量較大。3.影響因素：注意抗原的稀釋；標(biāo)本應(yīng)避免混濁。17編輯版ppt代表性儀器：全自動系列化分析儀：olympusAU560,日立7600全自動生化分析儀。特定蛋白分析儀檢測前白蛋白、載脂蛋白A、B等。18編輯版ppt1.原理入射光I0透射光I吸光度A=lgI0/I＝k1bC復(fù)合物C復(fù)合物＝k2C抗原(抗體過量)二)免疫膠乳比濁法吸光度A

＝k3C抗原19編輯版ppt2.技術(shù)要點稀釋待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加抗體致敏膠乳溶液

孵育一定時間測定吸光度(A340nm)值制備劑量-反應(yīng)曲線A吸光度抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線20編輯版ppt3.方法評價：敏感度高（達(dá)ng/L）；穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備；

血清中的RF可與IgGFc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干擾。

21編輯版ppt代表性儀器：普通分光光度計自動生化分析儀：olympusAU56022編輯版ppt三)散射比濁法I0入射光

散射光Iα（5°—96°）I＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosα)］

Nγ2λ4散射光強度顆粒含量正相關(guān)顆粒大小正相關(guān)入射光波長負(fù)相關(guān)測量散射光的角度正相關(guān)23編輯版ppt顆粒直徑＜＜入射光波長顆粒直徑＞或＝入射光波長散射角度盡可能大：提高靈敏度；排除大顆粒的干擾24編輯版ppt第一階段第二階段速率散射比濁終點散射比濁25編輯版pptI0入射光

I＝K1C復(fù)合物散射光Iα（5°—96°）C復(fù)合物＝K2C抗原（Ab濃度恒定）I＝K3C抗原1.原理：抗原與過量抗體反應(yīng)達(dá)到平衡時，形成復(fù)合物不再增加，并在形成絮狀沉淀前，測定此時的溶液濁度?？乖贵w作用30-120min內(nèi)比濁，形成較小復(fù)合物（一）終點散射比濁法26編輯版ppt2.技術(shù)要點稀釋待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加最適工作濃度的抗體

孵育測定散射光強度I（450nm）繪標(biāo)準(zhǔn)曲線濁度抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線27編輯版ppt4secI2I2-I1抗原濃度I1>閥值7.5s-120sI1I1＜閥值稀釋標(biāo)本全量標(biāo)本1/10標(biāo)本量28編輯版ppt定時散射比濁法測定原理示意圖29編輯版ppt4.方法評價：可自動化；敏感度達(dá)ug/L水平，高于透射比濁法；但反應(yīng)時間較長(第二階段)。3.抗原過量檢測：抗體過量：閾值限：。30編輯版ppt代表性儀器：DadeBehing公司：

BN-100BN-ProspecBN-Ⅱ特定蛋白系統(tǒng)。31編輯版pptBNProSpec全自動特定蛋白分析儀32編輯版ppt（二）速率散射比濁法1.原理：

是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法；速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量；連續(xù)測定各時間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1～2min即可完成。33編輯版ppt抗原抗體復(fù)合物形成的速率

累計時間（s）形成IC總量速率累計時間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

2034編輯版ppt抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化35編輯版ppt36編輯版ppt2.技術(shù)要點稀釋待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加最適工作濃度的抗體孵育立即比濁（速率單位RU）繪標(biāo)準(zhǔn)曲線RU抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線37編輯版ppt全量標(biāo)本量適量標(biāo)本稀釋標(biāo)本ARRAY360：自動進(jìn)行1:6、1:36、1:216和1:1296等稀釋度稀釋，也可以根據(jù)需要臨時設(shè)定稀釋度。

38編輯版ppt3.方法評價：可自動化，快速；（在第一階段檢測、60s內(nèi)完成測定）敏感度高，最小檢出量達(dá)μg/L水平；重復(fù)性好（CV＜5%)；但抗體的質(zhì)量要求高，儀器和試劑較貴。39編輯版ppt代表性儀器：美國BECKMAN公司：全自動特定蛋白分析系統(tǒng)ARRAY360IMMAGE全自動特定蛋白分析儀

40編輯版pptIMMAGE全自動特定蛋白分析儀41編輯版ppt

1.抗原抗體比例：抗體過量；抗原過量監(jiān)測

2.抗體的質(zhì)量：特異性高、親和力好、效價高

3.增濁劑的使用：（提高反應(yīng)速度）

PEG6000，tween-20

（一）免疫比濁分析的影響因素

四）、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用42編輯版ppt4.偽濁度:

標(biāo)本（高血脂、反復(fù)凍融）抗體：效價低、特異性差

PEG濃度過高器材不清潔

5.入射光光源和波長：氦氖光源，633nm6.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制

43編輯版ppt（二）臨床應(yīng)用免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白：前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍(lán)蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。

44編輯版ppt原理：將可溶性抗原與相應(yīng)分別放入凝膠（如瓊脂、瓊脂糖等）內(nèi)進(jìn)行擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢茫纬扇庋劭梢姷拿庖叱恋砭€、沉淀環(huán)。第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗分類：①單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)

②雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest）③凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)45編輯版ppt抗體+瓊脂一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理Ag沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。46編輯版ppt37℃24-48h(二)技術(shù)要點系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本測量沉淀環(huán)直徑抗體+1.5%瓊脂56度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線47編輯版ppt

T1為16～24h；T2為24～48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線

t1為16～24h；t2為24～48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線大分子抗原Fahey曲線小分子抗原48編輯版pptC(mg/ml)d2(mm)Mancini曲線擴散＞48h、大分子抗原d

(mm)Fahey曲線擴散＜24h、小分子抗原logC繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：49編輯版ppt(三)影響因素1.抗原分子量

分子量大，擴散慢，沉淀環(huán)較??；分子量小，擴散快，沉淀環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標(biāo)準(zhǔn)品在血清學(xué)上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結(jié)果偏高或偏低。

2.抗體種類

實驗證明馬抗血清為1-10IU/ml，羊為0.4-4IU/ml，兔抗血清可測抗原0.1-1IU/ml，為提高實驗敏感度，應(yīng)選兔抗血清。50編輯版ppt3.抗體稀釋度

抗體濃度易小，因相應(yīng)沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，方法敏感度較高。但沉淀環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎(chǔ)上加大稀釋度以提高敏感度。51編輯版ppt4.擴散時間與溫度

擴散時間赿長，擴散溫度在4-37℃范圍內(nèi)，升高溫度，反應(yīng)時間縮短。注意擴散要達(dá)到終點后，其沉淀環(huán)直徑才與抗原含量呈一定關(guān)系?？乖吭礁撸_(dá)到一定關(guān)系所用擴散時間越長。52編輯版ppt5.每次都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并必須加測質(zhì)控血清；6.雙環(huán)現(xiàn)象（重鏈?。?.單克隆抗體測正常人多態(tài)性抗原，則抗體相對過量，結(jié)果降低；8.多克隆抗體測定單克隆蛋白，則抗原相對過量，結(jié)果增加。53編輯版ppt(四)方法評價一種簡便、實用的定量方法；不需特殊儀器制備；靈敏度稍差為1.25mg/L；耗時長,影響因素多（操作規(guī)范時，重復(fù)性和線性尚可依賴），目前臨床中少用。

54編輯版ppt(一)原理：AbAg染色標(biāo)本圖1.抗原抗體雙向自由擴散2.24小時出結(jié)果3.呈現(xiàn)沉淀線或弧

二、雙向瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)55編輯版ppt(二)操作步驟制板1.5%瓊脂、4ml／每片打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm加樣孵育37℃、24-48h56編輯版ppt

應(yīng)用(三)雙向瓊脂擴散試驗的應(yīng)用抗原或抗體的有無及純度；估算抗原及抗體的相對含量及相對分子量；分析抗原的性質(zhì)；滴定抗體的效價。57編輯版ppt4.抗原抗體純度鑒定

“1”

為單一抗原抗體系統(tǒng)。

“n”

為多個抗原抗體系統(tǒng)。*可以用混合抗原鑒定抗體純度。抗原抗體純度鑒定*可以用混合抗體鑒定抗原純度。58編輯版ppt1.檢測未知抗原或抗體AgAbABCDEF

A:濃度Ag、Ab及擴散率近似；B：濃度Ag、Ab近似，擴散率Ag＞Ab；C：濃度Ag、Ab近似，擴散率Ag＜Ab；D：濃度Ag＞Ab，擴散率近似；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab；估計相對含量及分子量59編輯版ppt2表示標(biāo)準(zhǔn)Ag1表示待檢Ag待檢Ag與標(biāo)準(zhǔn)抗原完全吻合；待檢Ag中含有與標(biāo)準(zhǔn)Ag相同的Ag；還有另外的Ag與Ab相對應(yīng)；待檢Ag有與Ab相對應(yīng)的Ag，但與標(biāo)準(zhǔn)Ag不同；待檢Ag與標(biāo)準(zhǔn)Ag性質(zhì)相同；但含量較低；抗原性質(zhì)分析60編輯版ppt1.周圍6個孔放不同稀釋度的相應(yīng)Ab。2.以出現(xiàn)沉淀線的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價。3.可進(jìn)行任意稀釋?？贵w效價滴定61編輯版ppt三、免疫電泳技術(shù)

(immunoelectrophoresistechnique)電泳技術(shù)+免疫擴散技術(shù)特點：1.高特異性；2.高分辨率、快速、微量。62編輯版ppt

電泳原理pH8～8.6

緩沖液中陰粒離子多等電點pH3～4分子量較小等電點pH5～6分子量較大陰粒離子少向正極電泳力小向正極電泳力大63編輯版ppt影響因素1.電場強度：恒定電流2～4mA/cm,恒定電壓2～10V/cm4.電滲作用：在電場中液體相對于固體的移動。2.溶液pH值：緩沖液偏堿性，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷3.離子強度：高，泳動慢；低，泳動快，緩沖能力↓0.05mol／L、pH8.6的巴比妥緩沖液64編輯版ppt

電滲作用帶負(fù)電的瓊脂靜電感應(yīng)-+--------------------++++++++++++++AV0-----------V65編輯版ppt一）、對流免疫電泳(counterimmunolelctrophresis,CIEP)(一)原理在pH8.6的瓊脂凝膠中：

抗體球蛋白：帶少量負(fù)電荷且分子較大，因此電泳力＜電滲力，泳向負(fù)極，放(+)；

抗原蛋白質(zhì)：帶較強負(fù)電荷且分子較小，因此電泳力＞電滲力，泳向正極，放(－)；電泳一定時間后，二者相向運動，形成肉眼可見的沉淀線。66編輯版ppt

示意圖I=3～4mA/cm、30min+1：Ag與Ab對應(yīng)；2：Ab＞Ag，Ag為弱陽性3：Ag＞＞＞Ab，

Ag強陽性4：Ag＞＞Ab，Ag含量較高；（二）操作步驟-1.2%巴比妥瓊脂凝膠67編輯版ppt(三)方法評價

簡便、快速；敏感度較雙相瓊脂擴散試驗高8~10倍，但分辨力較其低；可測出ug/ml級的蛋白質(zhì)；目前已不推薦使用。68編輯版ppt三、火箭免疫電泳

（rocketimmunoelectrophoresis,RIE)單向免疫擴散+電泳技術(shù)原理＋－AbAg峰形高低與抗原量成正比69編輯版ppt1.制板：56度將抗體混于凝膠中2.打孔：3.加樣4.電泳：抗原向正極泳動5.觀察沉淀峰6.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線+6～8mm5mm二）操作步驟70編輯版ppt沉淀峰高抗原濃度1.測定沉淀峰高度2.在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線71編輯版ppt注意事項2.瓊脂應(yīng)為無電滲或電滲很小1.電泳頂部云霧狀或圓形，應(yīng)繼續(xù)電泳3.標(biāo)本多時，應(yīng)將瓊脂板置于電泳槽上，搭橋并開啟電源后加樣，否則形成寬底。4.IgG在pH8.6的緩沖條件下凈電荷為零，因此需經(jīng)甲醛化處理

注意事項72編輯版ppt（四）方法評價：

與雙擴比較：敏感

較單擴散敏感10-16倍（達(dá)ug/ml以上）；

快速

僅需1h左右。但敏感度仍不高,方法繁瑣,影響因素較多。用途

適用快速診斷檢測。如乙型肝炎抗原的快速檢測。73編輯版ppt(一)原理觀察沉淀弧根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。雙相免疫擴散：區(qū)帶電泳：電泳抗原抗體四、免疫電泳

(immunoelectrophoresis,IEP)74編輯版ppt

(二)操作步驟莊榮輝(1985)博士論文.p.81+-