物理學(xué)發(fā)展史教學(xué)課件

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生物分子的檢測第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備

一．一般過程二．注意事項三．純化方案的設(shè)計和評價例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化材料的選擇和處理確立測定方法細胞的破碎有效成分的抽提有效成分的濃縮生物大分子分離純化的一般步驟

層析法電泳法超離心法超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點電沉淀有機溶劑沉淀透析│←前處理→│←粗分級→│←細分級→│材料選擇與處理細胞破碎（機械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→無細胞提取液→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶幾種主要沉淀方法比較調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表注意事項

1．控制適當?shù)膒H2．控制低溫3．注意提取過程中的溶液環(huán)境4．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化

純化步驟總蛋白總活力比活力純化倍數(shù)回收率

（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸鈣沉淀2129801412.64694、鹽析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、結(jié)晶0.12130107219.703第二節(jié)幾種重要的生物化學(xué)實驗技術(shù)一、層析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)一．層析技術(shù)（chromatography）1．層析技術(shù)一般原理2．層析技術(shù)分類及應(yīng)用層析技術(shù)原理

層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。樣品在層析時的移動速度可用遷移率Rf值表示：

樣品原點到斑點中心的距離

Rf=——————————————樣品原點到溶劑前沿的距離層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱氨基酸分析儀圖解緩沖液泵顯色反應(yīng)管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源層析法分類及原理（按分離原理分類）

吸附層析分配層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析各類層析的原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團的交換反應(yīng)離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）吸附層析（absorptionchromatography）

原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當?shù)娜軇┳髁鲃酉?。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。

載體：硅膠氧化鋁羥基磷石灰應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質(zhì)分配層析

原理：分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機溶劑為流動相（展開劑）。當流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點中的溶質(zhì)在水和有機相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進行不斷分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定分子篩層析（gel-filtrationchromatography）

原理基質(zhì)葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)離子交換層析（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時間進行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。層析時的聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動速率幾種主要層析方法比較二、電泳技術(shù)

1．電泳的一般原理2.電泳技術(shù)的類別、原理及應(yīng)用電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達到分離鑒定各組分的目的。電泳技術(shù)分類（按實驗裝置分類）

紙電泳

薄膜電泳

凝膠電泳

毛細管電泳垂直板凝膠電泳毛細管電泳常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS4、PAGE等電點聚焦3、瓊脂糖電泳4、毛細管電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

凝膠聚合反應(yīng)及催化系統(tǒng)

不連續(xù)PAGE

可產(chǎn)生的三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)SDS

原理：

當SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系?？捎孟率奖硎荆?/p>

LogM=a–b應(yīng)用:測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量免疫電泳immunoelectrophoresis

微量多槽免疫電泳火箭免疫電泳毛細管電泳

毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。毛細管電泳裝置示意圖高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集毛細管緩沖液-樣品緩沖液三、離心技術(shù)

1．離心機類別普通離心機6000轉(zhuǎn)/分高速離心機2-3萬轉(zhuǎn)/分

超速離心機

3萬轉(zhuǎn)/分2．沉降系數(shù)（S）概念3．超離心法類別沉降速度法（sedimentationvelocity）沉降平恒法（sedimentationeg