實(shí)驗(yàn)六放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察教學(xué)課件

實(shí)驗(yàn)六放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察1、合法而穩(wěn)定的權(quán)力在使用得當(dāng)時(shí)很少遇到抵抗?！ぜs翰遜2、權(quán)力會(huì)使人漸漸失去溫厚善良的美德。——伯克3、最大限度地行使權(quán)力總是令人反感；權(quán)力不易確定之處始終存在著危險(xiǎn)?！ぜs翰遜4、權(quán)力會(huì)奴化一切?！髻?、雖然權(quán)力是一頭固執(zhí)的熊，可是金子可以拉著它的鼻子走?！勘葘?shí)驗(yàn)六放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)六放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察1、合法而穩(wěn)定的權(quán)力在使用得當(dāng)時(shí)很少遇到抵抗?！ぜs翰遜2、權(quán)力會(huì)使人漸漸失去溫厚善良的美德。——伯克3、最大限度地行使權(quán)力總是令人反感；權(quán)力不易確定之處始終存在著危險(xiǎn)?！ぜs翰遜4、權(quán)力會(huì)奴化一切。——塔西佗5、雖然權(quán)力是一頭固執(zhí)的熊，可是金子可以拉著它的鼻子走?！勘葘?shí)驗(yàn)六、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及觀察2002年10月7日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)將2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了悉尼·布雷內(nèi)、羅伯特·霍維茨和約翰·蘇爾斯頓三位科學(xué)家，以表彰他們?cè)凇凹?xì)胞程序性死亡”這一領(lǐng)域中的開創(chuàng)性工作。他們不但發(fā)現(xiàn)在生物的器官發(fā)育過程中存在細(xì)胞程序性死亡，而且闡明了細(xì)胞程序性死亡過程中的基因規(guī)律。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解細(xì)胞凋亡的原理2.學(xué)習(xí)離體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法2.掌握利用普通顯微鏡和熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)的方法2.程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）定義：細(xì)胞在一定的生理或者病理?xiàng)l件下按照自身的程序結(jié)束其生存，是細(xì)胞接受指令后進(jìn)行的主動(dòng)性死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控。受內(nèi)在遺傳機(jī)制的控制主動(dòng)結(jié)束生命的過程。程序性死亡主要包括細(xì)胞凋亡（apoptosis）和細(xì)胞自噬（autophage)

，2.1細(xì)胞凋亡（apoptosis）定義：是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程.凋亡細(xì)胞將被鄰近的細(xì)胞或吞噬細(xì)胞所吞噬并消化2.2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素內(nèi)源性因素；內(nèi)源性的因素包括細(xì)胞凋亡誘發(fā)機(jī)制（如Ｆas配體、腫瘤壞死因子等）的激活和抑制機(jī)制（生長因子、激素、受體因子等增殖性因子）的失活。外源性的因素；外源性的因素包括放射線、熱休克等物理性因素，藥物、毒物等化學(xué)性因素以及病毒、細(xì)菌等生物學(xué)因素。2.3細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征生物化學(xué)特征

DNA片段化大分子的合成

tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達(dá)到較高的水平。形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞變圓、胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞體積減小，染色質(zhì)凝聚，核碎裂成為染色質(zhì)塊（核碎片）。整個(gè)細(xì)胞通過發(fā)芽、起泡等方式產(chǎn)生一些球形突起，并在基部脫落形成大小不等的、內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器和核碎片的凋亡小體（apoptoticbody）。

凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布

凋亡小體的形成:核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個(gè)的凋亡小體凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞或吞噬細(xì)胞所吞噬并消化。細(xì)胞凋亡過程的3個(gè)階段壞死凋亡形態(tài)學(xué)特征膜完整性喪失胞漿和線粒體膨脹全細(xì)胞裂解

胞膜出芽，但保持完整染色體聚集在核膜周邊胞漿收縮、細(xì)胞核凝集最后細(xì)胞分裂為凋亡小體Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致線粒體膜通透性增加生化特征 離子內(nèi)環(huán)境失調(diào)非能量依賴性的（被動(dòng)過程，在4°C也可以發(fā)生）隨機(jī)消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)）PostlyticDNA斷裂

ATP依賴性的（主動(dòng)過程，在4°C不能發(fā)生）以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNAladder）PrelyticDNA斷裂線粒體釋放多種因子至胞漿中（細(xì)胞色素c、AIF）Caspases級(jí)聯(lián)活化膜對(duì)稱性改變（PS外翻）生理學(xué)特征影響群組細(xì)胞由非生理學(xué)因素引起（如補(bǔ)體攻擊、代謝中毒、缺氧等）被巨噬細(xì)胞吞噬周圍有明顯的炎癥反應(yīng)只影響單個(gè)細(xì)胞由生理學(xué)刺激誘導(dǎo)（如生長因子缺乏、激素環(huán)境改變等）被臨近細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬無炎癥反應(yīng)細(xì)胞的兩種死亡方式及比較細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI；吖啶橙。3電子顯微鏡觀察DAPI4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以穿透活細(xì)胞膜，對(duì)活細(xì)胞無毒副作用與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光與單鏈DNA結(jié)合后，熒光不增強(qiáng)λex

340

nm;λem

488

nm(nurDAPI)

λex

364

nm;λem

454

nm(DAPI-DNA-complex)（藍(lán)光）優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合力強(qiáng)，熒光強(qiáng)且穩(wěn)定缺點(diǎn)：自身有熒光，背景高。致癌NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocessbyusingDAPIHoechstHoechst是一種水溶性雙苯咪唑類化合物，可以穿透活細(xì)胞膜，Hoechst

33342比Hoechst

33258更易穿透活細(xì)胞膜，對(duì)活細(xì)胞的毒性較低

與DNA結(jié)合后熒光明顯增強(qiáng)λex

346nm;λem

460

nm(33258)λex

350

nm;λem

461

nm(Hoechst-DNA-complex)（藍(lán)光）在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜對(duì)Hoechst33258的攝取增高，并且由于染色體高度濃縮，染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合力強(qiáng)，熒光強(qiáng)于DAPI，缺點(diǎn)：自身有熒光，背景高。穩(wěn)定性比DAPI差，致癌結(jié)果正常細(xì)胞核有致密濃染的凋亡細(xì)胞核吖啶橙3,6-Bis(dimethylamino)acridinehydrochloride吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。細(xì)胞核因含DNA呈綠色，細(xì)胞質(zhì)及核仁因含RNA呈紅色；λex

495

nm;λem

526

nminTEbufferpH8.0λem

526

nmwithDNA,λem

650

nmwithDNA(enhancedfluorescencewithDNA）,優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合力強(qiáng)，穩(wěn)定缺點(diǎn)：自身有熒光，背景高。電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊。T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(掃描電鏡)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶基因的活化和表達(dá)，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)DNA的有控裂解，得到的DNA片段的長度為180-200bp的倍數(shù)。生化特征：DNA梯狀條帶細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

（自趙允、翟中和）最簡便可靠的方法2.4細(xì)胞凋亡的意義1.動(dòng)物機(jī)體靠對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的正負(fù)控制以及對(duì)細(xì)胞凋亡的正負(fù)控制來維持細(xì)胞總數(shù)的平衡和機(jī)體的生命活力。如：健康的成人體內(nèi)，在骨髓和腸中，每小時(shí)約有10億個(gè)細(xì)胞凋亡。

2.細(xì)胞凋亡在形態(tài)建成中起到重要作用（如手指和腳趾的發(fā)育），或者對(duì)于不再需要的構(gòu)造加以消除（如蝌蚪尾巴的消除）。3.細(xì)胞凋亡還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。細(xì)胞凋亡對(duì)發(fā)育中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)4.細(xì)胞凋亡的研究加深人們對(duì)生命現(xiàn)象及某些疾病的認(rèn)識(shí)實(shí)驗(yàn)六、細(xì)胞凋亡的觀察原理：HeLa細(xì)胞經(jīng)放線菌素D誘導(dǎo)后，可以產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞凋亡，利用熒光染色，可以觀察到典型的凋亡核（核碎片）。凋亡核呈顆粒團(tuán)狀分布，顏色較正常細(xì)胞致密且濃染。材料及設(shè)備：HeLa貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、250mg/ml放線菌素D（ActinomycinD）、吖啶橙熒光染料、卡諾氏固定液、0.9%生理鹽水、10%甘油熒光顯微鏡、蓋玻片、載玻片、鑷子、一次性吸管、離心機(jī)、EP管、培養(yǎng)皿、小燒杯等。實(shí)驗(yàn)步驟1.誘導(dǎo)：向處于對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞中加入250mg/ml的放線菌素D溶液10~15μl（終濃度0.5~0.75ug/ml），繼續(xù)培養(yǎng)18h左右；2.細(xì)胞收集和洗滌：將細(xì)胞懸液平均轉(zhuǎn)移到4個(gè)1.5毫升的EP管中，用1ml生理鹽水清洗細(xì)胞,去掉生理鹽水,將瓶壁上剩余細(xì)胞用1ml0.25%的胰酶消化3min后，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿,吹打生長面,平均合并至4個(gè)EP管中。以2000rpm離心6-8min，去上清；3.細(xì)胞預(yù)固定和固定：

加入0.9毫升生理鹽水，懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞分散，加入0.1毫升卡諾氏固定液，混勻；離心，去上清（保留0.1毫升生理鹽水）；

加入固定液至1毫升，小心懸浮細(xì)胞，室溫下固定處理10min，離心，去上清，加入0.1毫升固定液，小心充分混勻細(xì)胞；4.制片（空氣干燥法）取一滴細(xì)胞懸液，滴于傾斜放置的潔凈蓋玻片上，讓細(xì)胞均勻分散，自然干燥。coverslip5.染色：

滴加一滴吖啶橙熒光染液于標(biāo)本上，鋪開染液，置標(biāo)本于培養(yǎng)皿中，室溫下黑暗環(huán)境中染色10min，自來水小心沖洗,自然晾干（避光）。6.封片及觀察：在載玻片（slide）上滴一滴10%的甘油，用鑷子小心將貼有細(xì)胞的蓋玻片蓋在液滴上，細(xì)胞面向下，不要產(chǎn)生氣泡，及時(shí)于熒光顯微鏡下觀察。注意事項(xiàng)1.固定和染色時(shí)間的控制2.離心時(shí)，注意平衡3.