細(xì)胞因子（免疫學(xué)檢驗(yàn)課件）

細(xì)胞因子免疫系統(tǒng):產(chǎn)生免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)免疫器官免疫細(xì)胞免疫分子免疫系統(tǒng)的組成細(xì)胞因子

細(xì)胞因子（cytokine，CK）機(jī)體的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞能合成和分泌小分子的多肽類(lèi)因子，它們能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能，這些因子統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞因子。一、理化特性：多為小分子(8~30KD)蛋白或糖蛋白,多以單體形式存在，少數(shù)為二聚體(IL-10、IL-12等)或三聚體(TNF)。二、分泌特點(diǎn):多為旁分泌、自分泌，少數(shù)為內(nèi)分泌。第一節(jié)細(xì)胞因子的特性

（二）多向性：一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，幾種不同類(lèi)型細(xì)胞也可產(chǎn)生一種或幾種相同的細(xì)胞因子。三、產(chǎn)生特性:

（一）多源性:活化的各種免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞均可產(chǎn)生細(xì)胞因子。四、作用特點(diǎn):

（一）高效性：只需極少量（pmol/L水平）細(xì)胞因子就能產(chǎn)生明顯的生物學(xué)效應(yīng);

（二）多效性：一種細(xì)胞因子可對(duì)多種細(xì)胞發(fā)揮作用，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng);

（四）拮抗性：一種細(xì)胞因子可以抑制另一種細(xì)胞因子的某種生物學(xué)作用。如：IL-4IFN-γ

（三）重疊性：幾種不同細(xì)胞因子也可對(duì)同一種細(xì)胞發(fā)揮作用，產(chǎn)生相同或相似的生物學(xué)效應(yīng);

（五）協(xié)同性：一種細(xì)胞因子可以增強(qiáng)另一種細(xì)胞因子的功能；（六）兩面性：通常情況下，發(fā)貨抗感染、抗病毒、促進(jìn)造血和免疫調(diào)節(jié)等功能，但在一些異常情況下又參與炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)腫瘤等疾病的發(fā)生。

（七）非特異性：細(xì)胞因子以非特異性方式發(fā)揮作用,不受MHC限制，細(xì)胞因子必須與相應(yīng)受體結(jié)合才能發(fā)揮效應(yīng);

（八）網(wǎng)絡(luò)性：細(xì)胞因子之間通過(guò)合成分泌的作用相互調(diào)節(jié)、生物學(xué)效應(yīng)的相互影響，從而形成復(fù)雜而有序的因子網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡。一、根據(jù)細(xì)胞因子的來(lái)源分類(lèi)由單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子稱(chēng)為單核因子(monokine，MK)；由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子稱(chēng)為淋巴因子(lymphokine，LK)。二、依據(jù)細(xì)胞因子的生物學(xué)功能分類(lèi)可分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子等六大類(lèi)。第二節(jié)細(xì)胞因子的分類(lèi)（一）白細(xì)胞介素（interleukin,IL）

白細(xì)胞介素即是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類(lèi)細(xì)胞因子。在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，此外它們還參與機(jī)體的多種生理及病理反應(yīng)。（二）腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)：TNF-α、β（分別由單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生）

生物學(xué)效應(yīng)：1.抗腫瘤作用

2.抗病毒作用

3.免疫調(diào)節(jié)作用

4.促炎癥因子

5.致熱作用

6.惡病質(zhì)(三)干擾素（interferon,IFN）由病毒或干擾素誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能的小分子多肽。

I型IFN-α

IFN-β

抗病毒、抗腫瘤

II型IFN-r

免疫調(diào)節(jié)(四)集落刺激因子（colony-stimulatingfactor，CSF）：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、SCF、EPO、TPO等。(五)趨化因子（chemokine）：促進(jìn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等到達(dá)炎癥部位并激活。(六)生長(zhǎng)因子（growthfactor，GF）：TGF-β、EGF、NGF、VEGF、FGF等。

各類(lèi)細(xì)胞因子在造血過(guò)程中的作用二、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)一、參與和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答三、抗感染和抗腫瘤作用四、刺激造血功能第三節(jié)細(xì)胞因子的主要生物學(xué)作用五、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞因子對(duì)Th1和Th2細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用免疫調(diào)節(jié)作用1.細(xì)胞因子及受體缺陷

2.細(xì)胞因子過(guò)高表達(dá)

3.可溶性受體水平升高第四節(jié)細(xì)胞因子的醫(yī)學(xué)意義一、細(xì)胞因子與疾病的發(fā)生（一）引起發(fā)熱及內(nèi)毒素休克(IL-1、IL-6、TNF-α)（二）與某些腫瘤的形成有關(guān)(IL-10)（三）與某些免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生有關(guān)二、細(xì)胞因子與疾病的診斷

許多疾病都可造成細(xì)胞因子的改變，但一般缺少特異性。如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染性休克、免疫復(fù)合物腎病等疾病中IL-1均可出現(xiàn)增多。A.細(xì)胞因子補(bǔ)充療法B.細(xì)胞因子阻斷療法

三、細(xì)胞因子與疾病的治療1.治療方式例：IL-10：類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；EPO:血細(xì)胞減少癥IL-1、IFN：多種腫瘤。

第四節(jié)細(xì)胞因子相關(guān)檢驗(yàn)技術(shù)（一）細(xì)胞增殖測(cè)定法以細(xì)胞因子依賴(lài)性細(xì)胞株為靶向，通過(guò)觀(guān)察特定的細(xì)胞因子刺激依賴(lài)性細(xì)胞株的增殖，來(lái)評(píng)估細(xì)胞因子的活性水平。檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用方法有3H-TdR摻入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法等。一、細(xì)胞因子的生物學(xué)檢測(cè)法待檢樣品（細(xì)胞上清）指示細(xì)胞（CTLL-2）按不同稀釋度加入37oC，16h~20h加入3H-TdR（1Ci~5Ci）37oC，4h~6h收集細(xì)胞測(cè)定白細(xì)胞介素-2的測(cè)定示意圖

通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成的增加或減少來(lái)判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，DNA合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核苷或堿基的需求增多，若將核苷標(biāo)記上可以示蹤的同位素（3H/125I），通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。結(jié)果客觀(guān)易于自動(dòng)化；適用于大標(biāo)本量的測(cè)定

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法的特異性受依賴(lài)細(xì)胞株影響；放射性污染放射性核素?fù)饺敕ǎǘ┘?xì)胞毒活性測(cè)定對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，若與細(xì)胞共育將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，待測(cè)細(xì)胞因子作一系列稀釋后加至指示細(xì)胞培養(yǎng)體系，以檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)作為判斷指標(biāo)，死細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞因子的活性呈正比。應(yīng)用一系列稀釋的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，制作其活性與劑量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以此作為待測(cè)細(xì)胞因子活性的定量測(cè)定。本法常用于TNF等的測(cè)定（三）抗病毒活性測(cè)定法

本法常用于IFN等的測(cè)定，IFN可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染從而抑制細(xì)胞病變。（四）趨化活性測(cè)定法

多種細(xì)胞因子具有趨化活性，能分別誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等定向遷移。

利用分子生物學(xué)技術(shù)，制備出細(xì)胞因子的基因探針，通過(guò)分子雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子基因的表達(dá)，這是一種高度敏感和高度特異的檢測(cè)技術(shù)，目前在實(shí)驗(yàn)室研究中使用較廣，其缺點(diǎn)是操作較為煩瑣，測(cè)定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達(dá)，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平。二、細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測(cè)法（一）Northern印跡雜交法（二）斑點(diǎn)雜交法（dotbloting）（三）PCR與逆轉(zhuǎn)錄PCR（四）原位雜交和原位PCR

利用抗原抗體反應(yīng)的原理，制備出抗細(xì)胞因子的單克隆抗體或多克隆抗體，通過(guò)同位素、熒光素或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量分析細(xì)胞因子。（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

是定量分析中最常用方法。但不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。三、細(xì)胞因子的免疫學(xué)檢測(cè)法ELISA方法ELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISA的基本步驟，可作定性或定量分析。ELISA法不僅可以用于細(xì)胞因子檢測(cè)，也可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的測(cè)定敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。ELISA特異、簡(jiǎn)便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)(二)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT或ElisaSpot)

在包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，經(jīng)在有或無(wú)刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周?chē)?，并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA，即在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān)基本原理ELISPOT（三）流式細(xì)胞分析法

流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)，通過(guò)特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)單、快速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)，精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。1．分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞2．細(xì)胞固定3．封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)4．染色與分析基本步驟細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)激活膜抗原標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記使用流式細(xì)胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群：

Th1細(xì)胞IFN-γTh2細(xì)胞IL-4細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)直接或間接熒光抗體染色無(wú)需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：特異性高操作簡(jiǎn)