第四章層析分離技術(shù)課件

第四章層析分離技術(shù)基本原理層析分離是一種物理的分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別（分子大小、形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)），使各組分以不同的程度分布在兩個相中。.

層析法又稱色層分析法或色譜法，它是在1903-1906年由俄國植物學(xué)家M.Tswett首先系統(tǒng)提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續(xù)以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖

.層析分離具有如下基本特點優(yōu)點：（l）分離效率高。（2）應(yīng)用范圍廣。（3）選擇性強(qiáng)。（4）設(shè)備簡單，操作方便。缺點：處理量小、操作周期長、不能連續(xù)操作，因此主要用于實驗室，工業(yè)生產(chǎn)上還應(yīng)用較少。.層析的基本概念固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關(guān)鍵的作用流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一.分配系數(shù)：指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用K來表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。

K=Cs/Cm

其中Cs:固定相中的濃度，Cm:流動相中的濃度

主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。

.遷移率（或比移值）：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf減少；反之，會減少，Rf增加。相對遷移率：

在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來表示。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。.層析法的分類根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分：紙層析、薄層層析和柱層析

紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。

薄層層析是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析。

柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用；而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。

.根據(jù)流動相的形式分類：分為液相層析和氣相層析

氣相層析是指流動相為氣體的層析

液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化，大大限制了其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。根據(jù)分離的原理不同分類，分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。

.紙層析柱層析.定義：利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物各組分分離的方法。吸附劑的選擇常用的吸附劑除氧化鋁、硅膠和聚酞胺外，還有活性炭。吸附劑的種類很多，而對吸附劑的選擇尚無固定的法則，一般需通過小樣實驗來確定。第一節(jié)

吸附層析.裝柱（1）干法裝柱在柱下端加少許棉花或玻璃棉，再輕輕地撒上一層干凈的砂粒，打開下口，然后將吸附劑經(jīng)漏斗緩緩加入柱中，同時輕輕敲動色譜柱，使吸附劑松緊一致，最后，將色譜柱用最初洗脫劑小心沿壁加入，至剛好覆蓋吸附劑頂部平面，關(guān)緊下口活塞。（2）濕法裝柱將吸附劑加入合適量的色譜最初用洗脫劑調(diào)成稀糊狀，先把放好棉花、砂子的色譜柱下口打開，然后徐徐將制好的糊漿灌人柱子。注意，整個操作要慢，不要將氣泡壓人吸附劑中，而且要始終保持吸附劑上有溶劑，切勿流干，最后讓吸附劑自然下沉。當(dāng)洗脫劑剛好覆蓋吸附劑平面時，關(guān)緊下口活塞。1.1吸附層析的基本操作與應(yīng)用.上樣（1）濕法上樣把被分離的物質(zhì)溶在少量色譜最初用的洗脫劑中，小心加在吸附劑上層，注意保持吸附劑上表面仍為一水平面，打開下口，待溶液面正好與吸附劑上表面一致時，在上面撒一層細(xì)砂，關(guān)緊柱活塞口。（2）干法上樣多數(shù)情況下，被分離物質(zhì)難溶于最初使用的洗脫劑，這時可選用一種對其溶解度大而且沸點低的溶劑，取盡可能少的溶劑將其溶解。在溶液中加入少量吸附劑，拌勻，揮干溶劑，研磨使之成松散均勻的粉末，輕輕撒在色譜柱吸附劑上面，再撒一層細(xì)砂。.洗脫在裝好吸附劑的色譜柱中緩緩加入洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫，各組分先后被洗出。若用50g吸附劑，一般每份洗脫液量常為50rnLo但若所用洗脫劑極性較大或各成分的結(jié)構(gòu)很近似時，每份的收集量要小。

整個操作過程必須注意不使吸附柱表面的溶液流干，即吸附柱上端要保持一層溶劑。此外，應(yīng)控制洗脫液的流速，流速不應(yīng)太快。著流速過快，柱中交換來不及達(dá)到平衡，因而影響分離效果。.1.2聚酰胺薄膜層析聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。.

薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質(zhì)涂布于載體上形成薄層，然后按紙層析操作進(jìn)行展層。1.3薄層層析基本操作薄層板的制備樣品的預(yù)處理點樣、展層與顯色.基本原理分配柱層析是利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間的分配系數(shù)不同而使混合物得到分離。固定在柱內(nèi)的液體叫固定相，用作沖洗的液體叫流動相。為了使固定相固定在柱內(nèi)，需要有一種固體來吸牢它，這種固體本身不起什么分離作用，也沒有吸附能力，只是用來使固定相停留在柱內(nèi)，這種固體叫載體。進(jìn)行分離時先將含有固定相的載體裝在柱內(nèi)，加少量被分離的溶液后，用適當(dāng)溶劑進(jìn)行洗脫。在洗脫過程中，流動相與固定相發(fā)生接觸，由于樣品中各成分在兩相之間的分布不同，因此向下移動的速度不同，容易溶于流動相中的成分移動快，而在固定相中溶解度大的成分移動就慢，因此得到分離。第二節(jié)分配層析.分配柱層析的載體（一）硅膠吸水量為50%時仍為粉末狀，當(dāng)其吸水量在17%以上時，硅膠就失去其吸附作用，作為載體使用，此時硅膠層析則為分配層析。

（二）硅藻土具有微孔結(jié)構(gòu)，不具吸附作用，是現(xiàn)在使用最多的載體。其處理和裝柱方法基本同硅膠相似。（三）纖維素.分配柱層析的固定相與展開劑（一）固定相

常用的固定相有水、各種緩沖溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及為水所飽和的有機(jī)溶劑等。有時也采用“反相層析法”，即用有機(jī)溶劑為固定相，而以水或水溶液或與水混合的有機(jī)溶劑為流動相。

（二）展開劑流動相一般用為水所飽和的有機(jī)溶劑或水一有機(jī)溶劑互溶的混合液，一般常用的流動相溶劑有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯類等，或它們的混合物。反相層析法常用的流動相，則為正相層析法中的固定相，如水、各種水溶液（包括酸、堿、鹽與緩沖液）、低級醇類等。

.分配柱層析的基本操作（一）裝柱

裝柱前，將固定相與載體混合，如果用硅膠、纖維素等載體時，可以直加固定相直接混合，用硅藻土為載體先把硅藻土放在大量流動相液體中，在不斷攪拌下，逐漸加入固定相。

（二）加樣1、將被分離物配成濃溶液，用吸管輕輕沿管壁加到含固定相載體的上端，然后加流動相洗脫；2、被分離物溶液用少量含固定相的載體吸收，溶劑揮發(fā)后，加在層析管載體的上端，然后加流動相洗脫；3、用一塊比管徑略小的圓形濾紙吸附被分離物溶液，溶劑揮發(fā)后，放在載體上，然后加流動相洗脫。.分配柱層析的特點與應(yīng)用（一）特點：分配柱層析具有載體來源容易、分離成本低、流速快等特點,適用于分離極性比較大、在有機(jī)溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。（二）應(yīng)用：分配柱層析多用于分離親水性的成分，如苷類、糖及氨基酸類。.3.1原理與特點電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其他的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。

離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。第三節(jié)離子交換層析.（一）離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。

（二）離子交換劑的電荷基團(tuán)

根據(jù)與基質(zhì)共價結(jié)合的電荷基團(tuán)的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。

（三）交換容量

交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。3.2離子交換層析劑的基本知識.（四）離子交換劑的選擇、處理和保存

4.1離子交換劑的選擇

取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH值下所帶的電荷，離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關(guān)。4.2離子交換劑的處理和保存

處理：干粉狀的離子交換劑首先要進(jìn)行膨化，再用酸堿分別浸泡4.3離子交換樹脂的選擇依據(jù).3.3離子交換柱層析的操作與應(yīng)用（一）離子交換柱層析的操作1．層析柱2．平衡緩沖液3．上樣4．洗脫緩沖液5．洗脫速度6．樣品的濃縮、脫鹽（二）離子交換柱層析的應(yīng)用1.水處理2.分離純化小分子物質(zhì)3.分離純化生物大分子物質(zhì).4.1凝膠層析的原理

凝膠層析又稱分子排阻層析、分子篩層析或凝膠過濾。它是指混合物隨流動相經(jīng)固定相（凝膠）的層析柱時，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。

固定相（凝膠）是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于凝膠顆粒之外，因而具分子篩的性質(zhì)。又因整個層析過程一般不變換洗脫液，好像過濾一樣，故也稱凝膠過濾。第四節(jié)凝膠層析.3.2凝膠柱層析的操作.3.2凝膠柱層析的操作特點凝膠柱層析優(yōu)點：（1）分離條件溫和，因此不易引起生物樣品的變性失活；（2）每次分離操作之后，層析劑無需再生就可重復(fù)利用（3）工作范圍廣，分離的分子質(zhì)量范圍可從幾百到數(shù)百萬；（4）設(shè)備簡單，分離機(jī)理簡單，易于操作；（5）樣品回收率高，幾乎可達(dá)100%。凝膠層析的缺點：凝膠層析上樣量小，操作壓力不能高，流速較慢。.（1）主要用于脫鹽

（2）類分離

（3）分級分離

（4）生物大分子分子量的測定

（二）凝膠柱層析的特點與應(yīng)用.親和柱層析的原理（一）配基固定化：選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯(lián)，或共價結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)；（二）吸附樣品：親和吸附介質(zhì)選擇性吸附酶或其他生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除；（三）樣品解析：選擇適宜的條件，使被吸附的親和介質(zhì)上的酶或其他生物活性物質(zhì)解吸第五節(jié)親合層析.

用于親和層析的理想載體常選用均一的珠狀顆粒，特別是瓊脂糖和交聯(lián)葡聚糖，但也使用合成的聚丙烯酰胺凝膠、纖維素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。選作配基的分子必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，該基團(tuán)不參與配基與生物分子的特異結(jié)合，但是卻可以用來連接配基與載體。將親和配基共價偶聯(lián)在載體的表面，即可制得親和吸附介質(zhì)。一般凝膠過濾介質(zhì)均可作為親和配基的載體來制備親和吸附介質(zhì)。親和吸附介質(zhì).親和柱層析的操作與應(yīng)用基本過程（1）進(jìn)料吸附（2）雜質(zhì)清洗（3）目標(biāo)產(chǎn)物洗脫（4）層析柱再生.

親和層析的特點與應(yīng)用

1、親和層析的特點：在生物制品分離和分析領(lǐng)域有寬廣的應(yīng)用開發(fā)前景。由于其具有簡便、快速、專一和高效等特點，親和層析的應(yīng)用十分廣泛，已普及到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。2、親和層析親和層析的應(yīng)用：（1）分離和純化各種生物分子（2）分離純化各種功能細(xì)胞（3）用于各種生化成分的分析檢測.第六節(jié)層析聚焦定義：將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離的技術(shù)。原理：是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點不同進(jìn)行分離的過程，因此本方法具有高分辨、高度濃