食品酶學(xué)食品酶學(xué)基礎(chǔ)課件

第一節(jié)酶分子組成酶單純酶結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子輔因子輔酶

與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機物。輔基

與酶蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機物。金屬激活劑

金屬離子作為輔助因子。蛋白質(zhì)具有一級、二級、三級、四級結(jié)構(gòu)以及大分子組織形式。酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團的載體。第二節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與功能酶蛋白的結(jié)構(gòu),包括一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu),與酶的催化功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的改變會引起酶催化作用的改變或者喪失。研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是酶學(xué)的核心課題。

一、酶的活性中心（一）活性中心酶蛋白上只有少數(shù)氨基酸殘基參與酶對底物的結(jié)合和催化，這些相關(guān)氨基酸殘基在空間上比較靠近，形成一個與酶顯示活性直接有關(guān)的區(qū)域（在酶分子表面上具有三維結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域）,稱為酶的活性中心，又稱活性部位(activesite）。構(gòu)成活性中心的化學(xué)基團實際上就是酶蛋白氨基酸殘基的側(cè)鏈，有時尚包括肽鏈末端的氨基酸。胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ile16、His57、Asp102、Asp194、ser195。在酶原形式時它們分散在一條肽鏈上,但酶原經(jīng)激活后，形成A、B、C三條肽鏈。前3個殘基在B鏈,后2個在C鏈。依靠肽鏈的折疊，包括肽鏈間的二硫鍵，使這些互相遠離的基團靠近。(二)必需基團酶活性中心的一些化學(xué)基團為酶發(fā)揮催化作用所必需，故稱為必需基團。在酶活性中心以外的區(qū)域，也有不和底物直接作用的必需基團，稱為活性中心外的必需基團。這些基團與維持整個酶分子的空間構(gòu)象有關(guān)，間接地對酶的催化活性發(fā)揮作用。Koshland將酶分子中的氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團分成四類：1.接觸殘基(contactresidues)

如R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164和R165。和底物直接接觸,參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變，是活性中心的主要組成部分。這些殘基中的一個或幾個原子與底物分子的一個或多原子接觸的距離都是一鍵距離(即0.15~0.2nm)之內(nèi)。2.輔助殘基(auxiliaryresidues)

如R4，雖未直接與底物接觸，但在使酶與底物相互結(jié)合以及在輔助接觸殘基發(fā)揮作用上起著一定的作用。輔助殘基也是活性中心一個不可缺少的組成部分。接觸和輔助殘基組成酶的活性中心。接觸殘基的側(cè)鏈中，有的可能擔負和底物結(jié)合的作用,稱為結(jié)合基團；有的可能參與使底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的催化作用，稱為催化基團。結(jié)合基團也可參與催化作用輔助殘基，因不與底物接觸，只能參與輔助催化基團的作用，如質(zhì)子的供給或接受等。3、結(jié)構(gòu)殘基(structuralresidues)

如R10、R162、R169等，這些殘基在維持酶蛋白形成一種有規(guī)則的空間構(gòu)象方面起著重要作用。對酶活性的顯示也有一定貢獻，但離底物分子較遠，不能列人活性中心的范圍，屬于活性中心以外的必需基團。4、非貢獻殘基(non-contributingresidues)

在酶的活性中心外,不參與酶的催化功能，對酶活性的顯示不起作用。如圖中的R3、R5、R7以及圖中未列入的一些殘基,這些殘基可以被取代，甚至把它們?nèi)サ粢膊粫γ傅臉?gòu)象和功能產(chǎn)生重大改變。二、酶的一級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系一級結(jié)構(gòu)是酶的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，是催化功能的基礎(chǔ)。一級結(jié)構(gòu)的改變將使酶的催化功能發(fā)生相應(yīng)的改變。由于底物的誘導(dǎo)而引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，與適應(yīng)的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發(fā)揮其催化功能——誘導(dǎo)契合學(xué)說的基礎(chǔ)。一般由2~6個功能相關(guān)的酶組成，有利于生化反應(yīng)的連續(xù)進行，以提高酶的催化效率，同時也便于機體對酶的調(diào)控。（1）通過定量測定酶反應(yīng)的產(chǎn)物或底物的變化。底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結(jié)晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結(jié)晶，這也是酶一底物復(fù)合物的直接證據(jù)。在某些種類的細菌細胞中，正常時只存在痕跡量的誘導(dǎo)酶，但當培養(yǎng)基中有特定的誘導(dǎo)物(往往是該酶的底物或底物類似物)時，酶的數(shù)量能迅速增加1000多倍，尤其當這種底物是細胞唯一的碳源時。與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機物。（三）多酶復(fù)合體(multienzymecomplex)認為酶的結(jié)構(gòu)是剛性的，難以解釋一個酶可以催化正、逆兩個反應(yīng)，因產(chǎn)物(或逆反應(yīng)的底物)的形狀、構(gòu)象和底物完全不同。酶原是活性酶的前體，需經(jīng)激活才顯示出酶的性。過渡態(tài)是一種變動的分子。用電泳法分離LDH可得到5種同工酶區(qū)帶。過渡態(tài)學(xué)說涵蓋了對專一性機制和對高效性機制的解說。根據(jù)別構(gòu)效應(yīng)劑與酶結(jié)合后的效果，可將其分為兩類，使酶活性升高者稱為別構(gòu)激活劑，使酶活性降低者稱為別構(gòu)抑制劑。底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。二級和三級結(jié)構(gòu)的改變，也可以使酶形成正確的催化部位而發(fā)揮其催化功能。O急性心肌病變時，LDHl可升高。有一些多功能酶，其不同酶活力來自不同的結(jié)構(gòu)域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨?；幕钚?，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。利用同工酶對食用菌進行分類研究旨在探求不同菌種的酶譜差異，從而界定其親緣關(guān)系，以改善目前市場上食用菌菌種管理混亂、分類不清、甚至同種異名的現(xiàn)狀。核糖核酸酶在其C末端用羧酸酶去掉3個氨基酸時，對酶的活性幾乎沒有影響，而若用胃蛋白酶去掉C末端的4個氨基酸時，則酶活性全部喪失。核糖核酸酶，有活性沒活性有活性酶原是活性酶的前體，需經(jīng)激活才顯示出酶的性。由酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦?，可通過酶或氫離子的催化而實現(xiàn)。胰蛋白酶原在胰蛋白酶或腸激酶的作用下，使酶原變?yōu)榛钚缘拿?。酶原轉(zhuǎn)變成酶時，一級結(jié)構(gòu)僅僅發(fā)生微小的變化，在碳鏈的N-末端失去了一個六肽，從而使隱蔽的活性基團解放出來,形成了活性部位。許多酶都存在著二硫鍵。一般二硫鍵的斷裂將使酶變性而喪失其催化功能。但是某些情況下，二硫鍵斷開，而酶的空間構(gòu)象不受破壞時，酶的活性并不完全喪失；如果使二硫鍵復(fù)原，酶又重新恢復(fù)其原有的生物活性。三、酶的二級和三級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系二級、三級結(jié)構(gòu)是所有酶都必須具有的空間結(jié)構(gòu),是維持酶的活性部位所必須的構(gòu)型。當酶蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)徹底改變，就可使酶遭受破壞而喪失其催化功能。二級和三級結(jié)構(gòu)的改變，也可以使酶形成正確的催化部位而發(fā)揮其催化功能。由于底物的誘導(dǎo)而引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，與適應(yīng)的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發(fā)揮其催化功能——誘導(dǎo)契合學(xué)說的基礎(chǔ)。1.酶的變性和失活酶受到變性因素的作用，空間結(jié)構(gòu)破壞，其活性中心的構(gòu)象也隨著改變，酶因此失活。有時只要維持酶活性中心各基團的相對位置，即使一級結(jié)構(gòu)受到輕微破壞，酶活性也不會改變。牛胰核糖核酸酶(RNA酶)有4對二硫鍵及很多氫鍵維持其空間構(gòu)象;活性中心中有兩個組氨酸（His12及His119）。用枯草桿菌蛋白酶處理，被水解成為N端的⒛肽(S肽)和其余的104肽(S蛋白)兩個片段，分別含有His12和His119，兩者單獨存在時均無活力，但在pH7.0的介質(zhì)中，將兩者1:1混合，并使S肽與S蛋白間形成氫鍵及疏水鍵連接，則20與21位之間的肽鍵雖不能恢復(fù)，但活力能恢復(fù)。這是因為S肽上的His12又與s蛋白上的His119互相靠近，恢復(fù)了原來活性中心的空間構(gòu)象。酶蛋白的變性有時是可逆的。當某些化學(xué)變性劑去除后，酶可以恢復(fù)原有的空間構(gòu)象，并恢復(fù)酶活力。牛胰核糖核酸酶經(jīng)尿素及β-巰基乙醇處理后發(fā)生變性，當透析去除變性劑后，酶可自動折疊成具有催化活性的原始形式。2.活性中心的撓性近年來的研究證明：酶蛋白活力的變化和變性時空間構(gòu)象的改變并不是同步的。用紫外分光差光譜、熒光光譜、圓二色光譜、光散射和內(nèi)埋巰基暴露等手段研究肌酸激酶、核糖核酸酶、乳酸脫氫酶及3一磷酸甘油醛脫氫酶等在鹽酸胍和尿素溶液中變性不同時間的構(gòu)象變化(即肽鏈去折疊的過程)，同時測定酶活力的下降，發(fā)現(xiàn)：酶活力的喪失往往先于上述常規(guī)手段所測出的酶分子的整體構(gòu)象變化。熱變性實驗同樣證明，酶活性喪失在前，整體構(gòu)象變化在后。進一步用探測活性中心構(gòu)象的方法來研究(如3-磷酸甘油醛脫氫酶活性中心的巰基被羧甲基化后再經(jīng)激發(fā)光照，可在活性中心生成具有熒光的NAD共價結(jié)合物，可通過熒光改變來探測活性中心的構(gòu)象變化)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性中心的構(gòu)象的改變先于酶分子整體的構(gòu)象改變，而且與活力喪失幾乎同步。即：酶的活性中心的空間結(jié)構(gòu)相對酶分子整體而言，處于分子中一個撓性的局部區(qū)域，是由較弱的化學(xué)鍵維持其空間結(jié)構(gòu)，對各種變性因素較為敏感。低濃度的變性劑在一定條件有時反而使酶激活，也可證明活性中心的可塑性。3.酶分子的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domain)是指蛋白質(zhì)肽鏈中一段較獨立的具有完整、致密立體結(jié)構(gòu)的區(qū)域，一般由40~400個氨基酸殘基組成。大多數(shù)酶都有一個以上的結(jié)構(gòu)域，如彈性蛋白酶兩個十分類似的結(jié)構(gòu)域，而木瓜蛋白酶則有兩個很不一樣的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)肽鏈的折疊和變構(gòu)調(diào)節(jié)等現(xiàn)象中具有重要作用。不同的結(jié)構(gòu)域常有不同的功能。在大多數(shù)蛋白激酶中，兩個不同功能的區(qū)結(jié)構(gòu)域一般都存在于一條肽鏈中，形成催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，如cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)，鈣-甘油二酶(佛波酯)一磷脂依賴的蛋白激酶C(PKC)以及具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長因子受體，其調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域都位于N側(cè)，催化結(jié)構(gòu)域位于C側(cè)。有一些多功能酶，其不同酶活力來自不同的結(jié)構(gòu)域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨酰化的活性，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。已發(fā)現(xiàn)與凝血及纖維蛋白溶解有關(guān)的蛋白酶由6種不同的結(jié)構(gòu)域以不同的組合方式裝配而成，包括:γ一羧基谷氨酸域、表皮生長因子域、三環(huán)(kringle)結(jié)構(gòu)域、指(finger)結(jié)構(gòu)域和接觸因子(CF)域以及類胰蛋白酶的催化域。不同蛋白酶中的相同結(jié)構(gòu)域則往往有相同或類似的功能?？梢园呀Y(jié)構(gòu)域看成是酶蛋白中的一個功能單位。對結(jié)構(gòu)域的研究正方興未艾，將來有可能利用不同的結(jié)構(gòu)域用DNA重組技術(shù)組裝成新的人工酶蛋白。四、酶的四級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系具有四級結(jié)構(gòu)的酶，按其功能可分為兩類：一類與催化作用有關(guān)，另一類與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切。只與催化作用有關(guān)的具有四級結(jié)構(gòu)的酶：由數(shù)個相同的亞基組成，每個亞基都有一個活性中心。四級結(jié)構(gòu)完整時，酶的催化功能才會充分發(fā)揮出來。當四級結(jié)構(gòu)被破壞時，亞基被分離，若采用的分離方法適當，被分離的亞基仍保留著各自的催化功能。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶用溫和的琥珀酸的方法使四級結(jié)構(gòu)解離時，分離得到的亞基仍各自保持催化功能；當用強烈的條件如酸、堿、表面活性劑等破壞其四級結(jié)構(gòu)時，得到的亞基沒有催化活性。與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的具有四級結(jié)構(gòu)的酶：其組成亞基中，有的亞基具有調(diào)節(jié)中心（激活中心和/或抑制中心），使酶的活性受到激活或者抑制，調(diào)節(jié)酶反應(yīng)的速度和代謝過程。修飾酶活性的改變是通過共價鍵結(jié)合，別構(gòu)酶活性的改變是通過非共價鍵結(jié)合。不是酶的底物或酶的抑制物，不能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，或即使有少許變化，也不能使酶分子與有關(guān)催化基團處于互補契合位置?？山忉屆傅牧Ⅲw化學(xué)專一性和底物飽和曲線動力學(xué)。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。進一步用探測活性中心構(gòu)象的方法來研究(如3-磷酸甘油醛脫氫酶活性中心的巰基被羧甲基化后再經(jīng)激發(fā)光照，可在活性中心生成具有熒光的NAD共價結(jié)合物，可通過熒光改變來探測活性中心的構(gòu)象變化)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性中心的構(gòu)象的改變先于酶分子整體的構(gòu)象改變，而且與活力喪失幾乎同步。（2）反應(yīng)速度與酶量呈線性關(guān)系即要滿足[S。低濃度的變性劑在一定條件有時反而使酶激活，也可證明活性中心的可塑性。Katal的定義是每秒鐘催化1mol底物發(fā)生轉(zhuǎn)變的酶量，即：1mol/s。體內(nèi)酶促化學(xué)修飾反應(yīng)往往是連鎖反應(yīng)，即一種酶經(jīng)化學(xué)修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子進行化學(xué)修飾，每修飾一次就產(chǎn)生一次放大效應(yīng)。幾乎總是選擇一對對映體中的一種形式做底物，除非酶的特異功能是催化對映體的異構(gòu)化。有時只要維持酶活性中心各基團的相對位置，即使一級結(jié)構(gòu)受到輕微破壞，酶活性也不會改變。有一些多功能酶，其不同酶活力來自不同的結(jié)構(gòu)域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨酰化的活性，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。2、酶作用的專一性機制胰蛋白酶對羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)特異性。已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的同工酶達數(shù)百種，其中研究得最多的是乳酸脫氫酶(LDH)。哺乳動物中有5種乳酸脫氫酶同工酶.由于底物的誘導(dǎo)而引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，與適應(yīng)的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發(fā)揮其催化功能——誘導(dǎo)契合學(xué)說的基礎(chǔ)。組成寡聚酶的亞基可以相同，也可以不同。過渡態(tài)是一種變動的分子。熱變性實驗同樣證明，酶活性喪失在前，整體構(gòu)象變化在后。與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機物。第三節(jié)酶催化作用的基本理論有過各種酶催化學(xué)說。早期學(xué)說的中心思想是底物的活化，到⒛世紀60年代，隨著新技術(shù)的發(fā)展，從而亦考慮到在催化反應(yīng)中，酶本身功能基團的作用。酶在進行催化反應(yīng)時，首先和底物形成ES絡(luò)合物，這樣分子間的催化反應(yīng)就變?yōu)榉肿觾?nèi)的催化反應(yīng)。一、酶－底物復(fù)合物酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物（或稱中間絡(luò)合物）。復(fù)合物的形成是專一性決定的過程，也是變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)的過程，同時又是誘導(dǎo)契合過程。由于中問復(fù)合物的形成，酶和底物的結(jié)構(gòu)都將發(fā)生有利于催化反應(yīng)進行的變化。（一）酶一底物復(fù)合物存在的證據(jù)光譜技術(shù)是證明ES復(fù)合物存在的有效手段。醇脫氫酶（ADH）的底物NADH在游離狀態(tài)下，于340nm處有一吸收峰，但加入ADH后,吸收峰移向328nm，再加入巰基試劑對氯汞苯甲酸又使吸收峰回到340nm，證明NADH和ADH的結(jié)合是通過ADH的巰基介導(dǎo)的。催化絲氨酸和吲哚合成色氨酸的色氨酸合成酶含有磷酸吡哆醛輔基，后者能在激發(fā)下發(fā)出熒光。當單加入絲氨酸而尚無吲哚時,其熒光強度顯著增加，再加入吲哚，就使熒光淬滅，低于單獨酶的熒光，這就證明酶-絲氨酸復(fù)合物和酶-絲氨酸-吲哚復(fù)合物的存在。大分子底物和酶的復(fù)合物可用電子顯微鏡直接觀察DNA聚合酶與DNA的復(fù)合物。即使小分子底物也可用X射線衍射法獲得酶-底物復(fù)合物的信息，如羧肽酶A是通過哪些殘基和底物甘氨酰-L-酪氨酸結(jié)合的以及溶菌酶的最小六糖底物是怎樣“躺”在酶分子表面的狹長凹穴中，目前都已研究清楚。有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結(jié)晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結(jié)晶，這也是酶一底物復(fù)合物的直接證據(jù)?，F(xiàn)已充分證明:底物是通過酶的活性中心和酶結(jié)合的。(二)酶與底物形成復(fù)合物的作用力酶與底物的結(jié)合與穩(wěn)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)的力是相同的。1.離子鍵底物分子上的電荷和酶分子上相反電荷之間的作用,離子鍵受溶劑、鹽濃度、酶活性部位的微環(huán)境以及酶活性部位的側(cè)鏈基團等因素的影響。2.氫鍵底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。酶分子可以在主鏈與側(cè)鏈之間以及某些側(cè)鏈之間形成氫鍵。氫鍵在水中仍然可以保持，但強度減弱。在酸、堿液中氫鍵不存在。在高溫或各種變性劑的作用下，氫鍵會被破壞。3.范德華力一種非專一性的相互作用力，比離子鍵和氫鍵都弱。酶與底物之間的有效范德華引力作用,，只有在它們相互之間處于立體互補的情況下才能發(fā)生作用。在酶和底物的結(jié)合過程中，許多原子基團間的范德華引力的總和將會產(chǎn)生相當大的作用。二、酶的催化作用本質(zhì)酶和一般催化劑的共性用量少而催化效率高；它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。酶本身在反應(yīng)前后也不發(fā)生變化。酶能夠穩(wěn)定底物形成的過渡狀態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)的進行。一般催化劑反應(yīng)活化能反應(yīng)總能量變化酶促反應(yīng)活化能非催化反應(yīng)活化能初態(tài)終態(tài)能量改變活化過程酶促反應(yīng)活化能的改變過渡態(tài)三、酶作用的專一性機制（一）酶作用的專一性（底物特異性）（Substrate-specificity）（1）低特異性（Lowspecificity）:不能辨別底物，僅能對裂開的鍵表現(xiàn)特異性，如非特異性脂酶。

（2）基團特異性（Groupspecificity）:對于相鄰于特定基團的一個特殊的化學(xué)鍵表現(xiàn)出特異性。

胰蛋白酶對羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)特異性。

O‖X-NH-CH-C-NH-CH-COOH(精氨酸或賴氨酸)||R1R2。（3）絕對特異性（Absolutespecificity）酶僅作用于一種底物并催化一個反應(yīng)。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。（4）立體化學(xué)特異性（Stereochemicalspecificity）通常顯示出正確無誤和完全的立體定向性，能區(qū)別光學(xué)或立體異構(gòu)體。幾乎總是選擇一對對映體中的一種形式做底物，除非酶的特異功能是催化對映體的異構(gòu)化。（二）酶作用的專一性機制有多種學(xué)說，得到廣泛支持的有：鎖鑰學(xué)說誘導(dǎo)契合學(xué)說過渡態(tài)學(xué)說共同點：酶的作用專一性必須通過它的活性中心和底物結(jié)合后才表現(xiàn)出來。在大多數(shù)蛋白激酶中，兩個不同功能的區(qū)結(jié)構(gòu)域一般都存在于一條肽鏈中，形成催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，如cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)，鈣-甘油二酶(佛波酯)一磷脂依賴的蛋白激酶C(PKC)以及具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長因子受體，其調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域都位于N側(cè)，催化結(jié)構(gòu)域位于C側(cè)。當單加入絲氨酸而尚無吲哚時,其熒光強度顯著增加，再加入吲哚，就使熒光淬滅，低于單獨酶的熒光，這就證明酶-絲氨酸復(fù)合物和酶-絲氨酸-吲哚復(fù)合物的存在。其活性的改變可以決定全部反應(yīng)的總速度，甚至可以改變代謝的方向，故又稱為限速酶(或關(guān)鍵酶)。1894年，德國有機化學(xué)家E.酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。胰蛋白酶對羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)特異性。底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。其有無及含量的多少受外界條件的影響。但是某些情況下，二硫鍵斷開，而酶的空間構(gòu)象不受破壞時，酶的活性并不完全喪失；與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機物。有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結(jié)晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結(jié)晶，這也是酶一底物復(fù)合物的直接證據(jù)。在某些種類的細菌細胞中，正常時只存在痕跡量的誘導(dǎo)酶，但當培養(yǎng)基中有特定的誘導(dǎo)物(往往是該酶的底物或底物類似物)時，酶的數(shù)量能迅速增加1000多倍，尤其當這種底物是細胞唯一的碳源時。底物與酶之間存在某種立體專一結(jié)合。酶原轉(zhuǎn)變成酶時，一級結(jié)構(gòu)僅僅發(fā)生微小的變化，在碳鏈的N-末端失去了一個六肽，從而使隱蔽的活性基團解放出來,形成了活性部位。一類較復(fù)雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構(gòu)中心。早期學(xué)說的中心思想是底物的活化，到⒛世紀60年代，隨著新技術(shù)的發(fā)展，從而亦考慮到在催化反應(yīng)中，酶本身功能基團的作用。對結(jié)構(gòu)域的研究正方興未艾，將來有可能利用不同的結(jié)構(gòu)域用DNA重組技術(shù)組裝成新的人工酶蛋白。輔助殘基也是活性中心一個不可缺少的組成部分。如果使二硫鍵復(fù)原，酶又重新恢復(fù)其原有的生物活性。但是某些情況下，二硫鍵斷開，而酶的空間構(gòu)象不受破壞時，酶的活性并不完全喪失；酶蛋白的結(jié)構(gòu),包括一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu),與酶的催化功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的改變會引起酶催化作用的改變或者喪失。急性心肌病變時，LDHl可升高。O酶蛋白的結(jié)構(gòu),包括一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu),與酶的催化功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的改變會引起酶催化作用的改變或者喪失。三、酶的二級和三級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系由于中問復(fù)合物的形成，酶和底物的結(jié)構(gòu)都將發(fā)生有利于催化反應(yīng)進行的變化。一種非專一性的相互作用力，比離子鍵和氫鍵都弱?？山忉屆傅牧Ⅲw化學(xué)專一性和底物飽和曲線動力學(xué)。能解釋鎖鑰學(xué)說不能解釋的實驗事實，但也有局限性：酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物（或稱中間絡(luò)合物）。牛胰核糖核酸酶經(jīng)尿素及β-巰基乙醇處理后發(fā)生變性，當透析去除變性劑后，酶可自動折疊成具有催化活性的原始形式。酶活測定的條件，定義。R1R2胞內(nèi)酶(intracellularenzyme）是指那些在合成后仍留在細胞內(nèi)的酶;（一）單體酶(monomericenzyme)表示正在形成和斷裂的化學(xué)鍵有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結(jié)晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結(jié)晶，這也是酶一底物復(fù)合物的直接證據(jù)。有一些多功能酶，其不同酶活力來自不同的結(jié)構(gòu)域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨?；幕钚?，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。一種非專一性的相互作用力，比離子鍵和氫鍵都弱。1kat=6×107U1U=1.1.鎖鑰學(xué)說1894年，德國有機化學(xué)家E.Fisher提出。酶與底物結(jié)合時，酶活性中心的結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)必須吻合，就如同鎖和鑰匙一般，非常配合地結(jié)合形成中間復(fù)合物)。當中間復(fù)合物形成時，會促進底物結(jié)構(gòu)發(fā)生某些化學(xué)變化(如底物分子的鍵被扭曲)，變形而斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物?？山忉屆傅牧Ⅲw化學(xué)專一性和底物飽和曲線動力學(xué)。

在酶的表面存在著一個特殊形狀的活性部位，這個活性部位在結(jié)構(gòu)上能與底物精確地互補。底物與酶之間存在某種立體專一結(jié)合。底物類似鑰匙，酶類似鎖。獲得相當多的事實支持。乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解。要求底物中的膽堿氮帶正電，為此可推測：酶分子中至少有一個陰離子部位與酯解部位。事實是，這兩部位間有嚴格的距離，膽堿和?；g多或少一個-CH2-都不適于作底物或競爭抑制劑，而符合這種鍵長、鍵角要求的化合物都能與該酶發(fā)生作用（被酶催化水解或者抑制酶）。缺點：認為酶的結(jié)構(gòu)是剛性的，難以解釋一個酶可以催化正、逆兩個反應(yīng)，因產(chǎn)物(或逆反應(yīng)的底物)的形狀、構(gòu)象和底物完全不同。2.誘導(dǎo)契合學(xué)說1958年，Koshand提出酶分子(包括輔酶在內(nèi))的構(gòu)象與底物原來并非恰當吻合，只有底物分子與酶分子相碰時，才可誘導(dǎo)后者的構(gòu)象變得能與底物配合，然后才結(jié)合形成中間復(fù)合物，進而引起底物分子發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化。誘導(dǎo)楔合模型要點：（a）當?shù)孜锱c酶的活性部位結(jié)合時，酶蛋白的幾何形狀有相當大的改變；（b）催化基團的精確定向?qū)τ诘孜镛D(zhuǎn)變成產(chǎn)物是必需的；（c）底物誘導(dǎo)酶蛋白幾何形狀的改變使得催化基團能精確地走向和底物結(jié)合到酶的活性部位上去。A、B催化基團C結(jié)合基團在用X光衍射法研究溶菌酶、彈性蛋白酶等與底物結(jié)合后結(jié)構(gòu)的改變中得到了證實。能解釋鎖鑰學(xué)說不能解釋的實驗事實，但也有局限性：不是酶的底物或酶的抑制物，不能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，或即使有少許變化，也不能使酶分子與有關(guān)催化基團處于互補契合位置。實際上，大于底物或小于底物的類似物亦能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化。3.過渡態(tài)學(xué)說(transitionstatetheory)LinusPauling（20世紀40年代）提出的過渡態(tài)理論認為：酶與底物的過渡態(tài)互補，親和力最強，釋放出結(jié)合能使ES的過渡態(tài)能級降低，有利于底物分子跨越能壘，使酶促反應(yīng)大大加速。“過渡態(tài)”是反應(yīng)物分子處于被激活的狀態(tài)，是反應(yīng)途徑中分子具有最高能量的形式。不同于反應(yīng)中間物。它只不過是一個短暫的分子瞬間。在這一瞬間分子的某些化學(xué)鍵正在斷裂和形成并達到能崩解生成產(chǎn)物或再返回生成反應(yīng)物的程度。過渡態(tài)學(xué)說認為，酶的作用專一性既寓于酶與底物的結(jié)合，也寓于酶對底物的催化，酶與底物的結(jié)合不僅促成了結(jié)合基團和催化基團的正確取位，同時也為下一步酶對底物的催化做了準備。…….表示正在形成和斷裂的化學(xué)鍵乙酸乙酯的水解反應(yīng):過渡態(tài)看來:過渡態(tài)是一種變動的分子。20世紀70年代以來，對很多酶促反應(yīng)的過渡態(tài)類似物(人工設(shè)計出的類似過渡態(tài)的穩(wěn)定分子)的研究發(fā)現(xiàn)，這些過渡態(tài)類似物與酶的結(jié)合比底物與酶的結(jié)合緊密102~106倍，證明了酶與反應(yīng)過渡態(tài)互補的概念是正確的。過渡態(tài)學(xué)說涵蓋了對專一性機制和對高效性機制的解說。第四節(jié)酶在生物體內(nèi)存在的幾種形式

一、單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物酶和其他蛋白質(zhì)一樣，由⒛種L-氨基酸組成,也有特定的氨基酸排列和特定的空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)酶蛋白分子結(jié)構(gòu)可將酶分為三類。單體酶寡聚酶多酶復(fù)合物（一）單體酶(monomericenzyme)

僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應(yīng)。（二）寡聚酶（oligomericenzyme）寡聚酶具有四級結(jié)構(gòu)，至少有2個亞基,多的可達60個以上，相對分子質(zhì)量在3.5萬至百萬以上。組成寡聚酶的亞基可以相同，也可以不同。亞基之間以非共價鍵結(jié)合。有的亞基上有結(jié)合基團，叫結(jié)合亞基，有的亞基上有催化基團，叫催化亞基。亞基分離時沒有活性。（三）多酶復(fù)合體(multienzymecomplex)

多酶復(fù)合體是指幾個酶嵌合而成的絡(luò)合物，又稱多酶絡(luò)合物。一般由2~6個功能相關(guān)的酶組成，有利于生化反應(yīng)的連續(xù)進行，以提高酶的催化效率，同時也便于機體對酶的調(diào)控。丙酮酸脫氫酶系（E.coli）：丙酮酸脫氫酶（EⅠ）、硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（EⅡ）和二氫硫辛酰脫氫酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ堿性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲可解釋酶的立體化學(xué)專一性和底物飽和曲線動力學(xué)。不同的結(jié)構(gòu)域常有不同的功能。酶受到變性因素的作用，空間結(jié)構(gòu)破壞，其活性中心的構(gòu)象也隨著改變，酶因此失活。0的介質(zhì)中，將兩者1:1混合，并使S肽與S蛋白間形成氫鍵及疏水鍵連接，則20與21位之間的肽鍵雖不能恢復(fù)，但活力能恢復(fù)。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。根據(jù)酶蛋白分子結(jié)構(gòu)可將酶分為三類。乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ile16、His57、Asp102、Asp194、ser195。酶與底物之間的有效范德華引力作用,，只有在它們相互之間處于立體互補的情況下才能發(fā)生作用。由于底物的誘導(dǎo)而引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，與適應(yīng)的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發(fā)揮其催化功能——誘導(dǎo)契合學(xué)說的基礎(chǔ)。許多酶都存在著二硫鍵。不是酶的底物或酶的抑制物，不能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，或即使有少許變化，也不能使酶分子與有關(guān)催化基團處于互補契合位置。這些基團與維持整個酶分子的空間構(gòu)象有關(guān)，間接地對酶的催化活性發(fā)揮作用。一類較復(fù)雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構(gòu)中心。利用同工酶對食用菌進行分類研究旨在探求不同菌種的酶譜差異，從而界定其親緣關(guān)系，以改善目前市場上食用菌菌種管理混亂、分類不清、甚至同種異名的現(xiàn)狀。但是某些情況下，二硫鍵斷開，而酶的空間構(gòu)象不受破壞時，酶的活性并不完全喪失；一類較復(fù)雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構(gòu)中心。酶活測定的條件，定義。胞內(nèi)酶(intracellularenzyme）是指那些在合成后仍留在細胞內(nèi)的酶;當酶蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)徹底改變，就可使酶遭受破壞而喪失其催化功能。胰蛋白酶對羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)特異性。表示正在形成和斷裂的化學(xué)鍵二、同工酶（isozyme）同工酶是指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，各同工酶的理化性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)都存在很多差異。同工酶不僅存在于同一機體的不同組織中，也存在于同一組織細胞的不同亞細胞結(jié)構(gòu)中。已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的同工酶達數(shù)百種，其中研究得最多的是乳酸脫氫酶(LDH)。哺乳動物中有5種乳酸脫氫酶同工酶.

NAD+NADH+H+CH3-CHOH-COOHCH3-CO-COOH乳酸丙酮酸

用電泳法分離LDH可得到5種同工酶區(qū)帶。都是由H和M二種不同類型的亞基組成的四聚體。乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜同工酶的測定可作為某些疾病的診斷指標。正常人血清LDH主要來自紅細胞滲出，活力很低。當某一組織病變時，血清LDH同工酶電泳圖譜會發(fā)生變化。如肝細胞受損早期，LDH總活性在正常范圍內(nèi)，但LDH5升高；急性心肌病變時，LDHl可升高。同工酶的測定在食品檢測和鑒別中得到日益廣泛的應(yīng)用食用菌菌種純度的同工酶電泳鑒定利用同工酶對食用菌進行分類研究旨在探求不同菌種的酶譜差異，從而界定其親緣關(guān)系，以改善目前市場上食用菌菌種管理混亂、分類不清、甚至同種異名的現(xiàn)狀。選取目前銷售、應(yīng)用較為廣泛、代表性強的平菇和香菇菌種，測定其液培菌絲的酯酶和過氧化物酶譜帶。蜂蜜品質(zhì)同工酶電泳檢測比較兩種天然蜂蜜與摻假所用的工業(yè)淀粉酶的同工酶電泳，發(fā)現(xiàn)天然蜂蜜的淀粉酶同工酶酶譜和工業(yè)淀粉酶的同工酶酶譜存在差異。

三、別構(gòu)酶與修飾酶別構(gòu)酶(變構(gòu)酶)與修飾酶統(tǒng)稱為調(diào)節(jié)酶。調(diào)節(jié)酶通常在一連串的反應(yīng)中催化單向反應(yīng)，或催化反應(yīng)速度最慢的反應(yīng)步驟。其活性的改變可以決定全部反應(yīng)的總速度，甚至可以改變代謝的方向，故又稱為限速酶(或關(guān)鍵酶)。（一）別構(gòu)酶（allostericenzyme）一類較復(fù)雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構(gòu)中心?；钚灾行呢撠煂Φ孜锝Y(jié)合和催化，別構(gòu)中心則與調(diào)節(jié)催化速度有關(guān)。當某些代謝物以非共價方法結(jié)合于別構(gòu)中心部位后，可使酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶活性，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng)?？砂l(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶稱為別構(gòu)酶，可引發(fā)別構(gòu)效應(yīng)的代謝物稱為別構(gòu)效應(yīng)劑。別構(gòu)酶通常由多個亞基組成，活性中心和別構(gòu)中心可分布在不同的亞基，也可分布在同一亞基的不同部位，能結(jié)合別構(gòu)效應(yīng)劑的亞基為別構(gòu)亞基。別構(gòu)效應(yīng)劑一般為小分子代謝物，可以是別構(gòu)酶的底物，也可以是代謝通路上的產(chǎn)物。根據(jù)別構(gòu)效應(yīng)劑與酶結(jié)合后的效果，可將其分為兩類，使酶活性升高者稱為別構(gòu)激活劑，使酶活性降低者稱為別構(gòu)抑制劑。異檸檬酸脫氫酶是別構(gòu)酶，NAD+、ADP和檸檬酸是該酶的別構(gòu)激活劑，而NADH和ATP是別構(gòu)抑制劑。（二）修飾酶(modificationenzyme)1、修飾酶的類型某些酶能在其他酶的催化下，通過共價鍵可逆結(jié)合某種化學(xué)基團，從而改變其活性，這種作用稱為共價修飾調(diào)節(jié)，這類酶稱為共價修飾酶或化學(xué)修飾酶。修飾酶活性的改變是通過共價鍵結(jié)合，別構(gòu)酶活性的改變是通過非共價鍵結(jié)合。修飾酶的共價修飾有磷酸化/脫磷酸化、乙?；?去乙?；?、腺苷化/去腺苷化、甲基化/去甲基化、-SH/-S-S-等，其中磷酸化/脫磷酸化最為常見。2、修飾酶的特點（1）絕大多數(shù)修飾酶具有無活性/有活性(或低活性/高活性)兩種形式，催化其正逆兩方向反應(yīng)的酶不同，且受激素或第二信使的調(diào)節(jié)。（2）耗能少磷酸化/脫磷酸化是最常見的共價修飾。每個亞基磷酸化僅僅需1分子ATP，比生物合成多肽鏈消耗的ATP少得多，速度也快得多。（3）效率高由于化學(xué)修飾反應(yīng)一般是酶促反應(yīng)，且受體內(nèi)調(diào)節(jié)因子控制，故對調(diào)節(jié)信號有快速、放大的效應(yīng)。體內(nèi)酶促化學(xué)修飾反應(yīng)往往是連鎖反應(yīng)，即一種酶經(jīng)化學(xué)修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子進行化學(xué)修飾，每修飾一次就產(chǎn)生一次放大效應(yīng)。因此，極少量的調(diào)節(jié)因子經(jīng)化學(xué)修飾酶的逐級放大，可產(chǎn)生顯著的生理效應(yīng)。環(huán)磷腺苷

四、結(jié)構(gòu)酶(組成酶)與誘導(dǎo)酶根據(jù)合成與代謝的關(guān)系，將酶相對地分為結(jié)構(gòu)酶和誘導(dǎo)酶。結(jié)構(gòu)酶(structuralenzym)是細胞以恒定速率和恒定數(shù)量生成的那些酶類，亦稱組成酶。細胞中天然存在,含量較穩(wěn)定，一般不受外界條件的影響。誘導(dǎo)酶(inducedenzyme)是指細胞中進入特定的誘導(dǎo)物后,被誘導(dǎo)生成的。其有無及含量的多少受外界條件的影響。在某些種類的細菌細胞中，正常時只存在痕跡量的誘導(dǎo)酶，但當培養(yǎng)基中有特定的誘導(dǎo)物(往往是該酶的底物或底物類似物)時，酶的數(shù)量能迅速增加1000多倍，尤其當這種底物是細胞唯一的碳源時。五、胞內(nèi)酶與胞外酶按酶合成后分布和存在的位置,可將酶分為胞內(nèi)酶與胞外酶。胞內(nèi)酶(intracellularenzyme）是指那些在合成后仍留在細胞內(nèi)的酶;胞外酶(extracellularenzyme)是指那些在合成后分泌到細胞外而游離在發(fā)酵液中的酶。在中文文獻中常將“ectoenzyme”

譯為胞外酶,但它和通常所說的胞外酶(extracellularenzyme)不同,它是一種和細胞膜結(jié)合的酶,其活性中心位于細胞的外表面,指向細胞外空間,作用還未完全清楚。第五節(jié)酶活力測定1.酶活的定義酶活定義：在一定條件下，催化單位底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需的酶量。酶活單位

U：國際生物化學(xué)協(xié)會酶委員會定義：每分鐘催化1μmol底物發(fā)生轉(zhuǎn)變的酶量，即：1μmol/min。kat：酶活力的SI單位，即Katal。Katal的定義是每秒鐘催化1mol底物發(fā)生轉(zhuǎn)變的酶量，即：1mol/s。

1kat=6×107U1U=1.67×10-8kat

商業(yè)上，根據(jù)需要2．酶活力測定方法(Assayofenzymeactivity)

：（1）通過定量測定酶反應(yīng)的產(chǎn)物或底物的變化。（2）通過定量測定酶反應(yīng)底物中某一性質(zhì)的變化，如粘度等。

通常在酶的最適pH和離子強度以及指定的溫度下測定酶活。

直接測定酶活(directassay)

測定酶作用于底物或產(chǎn)物的形成速度

產(chǎn)物量時間

當[E。]遠遠小于[S。]時v=Vmax=k3[E。],v與[E。]成正比。

初速度

酶濃度不同酶濃度下產(chǎn)物量隨時間的變化初速度隨酶濃度的變化

酶活測定必須滿足的條件：（1）產(chǎn)物的量與時間呈線性關(guān)系即要測初速度。（2）反應(yīng)速度與酶量呈線性關(guān)系即要滿足[S。]遠遠