色譜概論和經(jīng)典液相色譜法

色譜概論和經(jīng)典液相色譜法第1頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第十六章色譜分析概論

第一節(jié)色譜過程和基本原理一、色譜法的由來

1．1906年由俄國植物學(xué)家Tsweet創(chuàng)立

植物色素分離見圖示

2．現(xiàn)在：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析

固定相——除了固體，還可以是液體

流動相——液體或氣體

色譜柱——各種材質(zhì)和尺寸

被分離組分——不再僅局限于有色物質(zhì)第2頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚

色帶第3頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示第4頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月一、色譜過程（一）色譜過程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例見圖示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離第5頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月二、色譜法定義、實質(zhì)定義：利用物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)建立的分離、分析方法實質(zhì)：分離三、分類：

1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜第6頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前2．按固定相的固定方式分：3．按分離機制分：平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細(xì)管柱色譜

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同

吸附色譜：利用物理吸附性能的差異

離子交換色譜：利用離子交換原理

空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同第7頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示色譜法簡單分類第8頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月四、基本類型色譜法的分離機制基本概念：固定相（s）；流動相（m）（一）吸附色譜法（二）分配色譜法（三）離子交換色譜法（四）空間排阻色譜法第9頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）吸附色譜法要求：固定相→吸附劑（硅膠或AL2O3）具表面活性吸附中心分離機制：見圖示吸附系數(shù)注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動相的性質(zhì)及溫度有關(guān)next吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYm

第10頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示分離機制：各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離吸附→解吸→再吸附→再解吸→無數(shù)次洗脫→分開

back第11頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示化學(xué)性質(zhì)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出back第12頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月固定相：吸附劑多孔性微粒狀物質(zhì)比表面積大，吸附中心多。（硅膠表面硅醇基）流動相：有機溶劑（極性強洗脫能力強）洗脫順序：1吸附中心的競爭

2組分與固定相的作用

3組分在流動相的溶解性第13頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）分配色譜法要求：固定相→機械吸附在惰性載體上的液體流動相→必須與固定相不為互溶載體→惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)分離機制見圖示

狹義分配系數(shù)注：K與組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫有關(guān)next第14頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示分離機制利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現(xiàn)分離連續(xù)萃取過程back第15頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月固定相：涂漬在在惰性載體材料上的液體又稱固定液。（化學(xué)鍵合相）流動相：1氣體：氫氣、氮氣

2液體：正相、反相（固定相與流動相極性相對強弱）洗脫順序：組分在流動相固定相中的溶解度相對大小決定。第16頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物分離機制見圖示選擇性系數(shù)

陽離子交換樹脂

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

注：Ks與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動相性質(zhì)、離子交換樹脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)next

固定離子可交換離子待測離子第17頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示分離機制：

依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現(xiàn)分離back第18頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）空間排阻色譜法要求：固定相→多孔性凝膠流動相→水——凝膠過濾色譜流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜分離機制見圖示滲透系數(shù)

注：Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動相的性質(zhì)無關(guān)next第19頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示分離機制：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離back第20頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)論：四種色譜的分離機制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡

K分別為吸附系數(shù)，狹義分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù)除了凝膠色譜法中的K僅與待測分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關(guān)外，其他三種K值都受組分的性質(zhì)、流動相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫的影響第21頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月五、色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開高效能——反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果高靈敏度——10-11~10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾~幾十分鐘完成分離一次可以測多種樣品應(yīng)用范圍廣——氣體，液體、固體物質(zhì)化學(xué)衍生化再色譜分離、分析對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)第22頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月六、基本概念（一）色譜流出曲線和有關(guān)概念

1．流出曲線和色譜峰

2．基線、噪音和漂移

3．保留值：色譜定性參數(shù)

4．色譜峰高和峰面積

5．色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù)

6．分離度第23頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1．流出曲線和色譜峰流出曲線（色譜圖）：電信號強度隨時間變化曲線色譜峰：流出曲線上突起部分第24頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前不對稱因子正常峰（對稱）非正常峰

前沿峰

拖尾峰色譜峰——fs在0.95~1.05之間——fs小于0.95——fs大于1.05第25頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2．基線、噪音和漂移

基線：當(dāng)沒有待測組分進(jìn)入檢測器時，反映檢測器噪音隨時間變化的曲線（穩(wěn)定—平直直線）噪音：儀器本身所固有的，以噪音帶表示（儀器越好，噪音越小）漂移：基線向某個方向穩(wěn)定移動（儀器未穩(wěn)定造成）第26頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月3．保留值：色譜定性參數(shù)保留時間tR：從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所需時間，即組分通過色譜柱所需要的時間死時間tm：不被固定相溶解或吸附的組分的保留時間（即組分在流動相中的所消耗的時間），或流動相充滿柱內(nèi)空隙體積占據(jù)的空間所需要的時間，又稱流動相保留時間調(diào)整保留時間tR’：組分的保留時間與死時間之差值，即組分在固定相中滯留的時間第27頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示第28頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月保留體積VR：從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗的流動相的體積

死體積Vm：不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相的體積，又指色譜柱中未被固定相所占據(jù)的空隙體積，即色譜柱的流動相體積（包括色譜儀中的管路、連接頭的空間、以及進(jìn)樣器和檢測器的空間）第29頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前調(diào)整保留體積VR/：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積相對保留值ri,s（選擇性系數(shù)α）：調(diào)整保留值之比第30頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前保留指數(shù)IX：指將待測物的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為(已知范圍內(nèi)組分的定性參數(shù))第31頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月4.色譜峰高和峰面積峰高：組分在柱后出現(xiàn)濃度最大時的檢測信號。峰面積：色譜曲線與基線間包圍的面積。第32頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示第33頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5．色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋荷V柱效參數(shù)峰寬W：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點切線與基線相交的截距標(biāo)準(zhǔn)差σ：正態(tài)分布色譜曲線兩拐點距離的一半

σ→對應(yīng)0.607h處峰寬的一半注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑高半峰寬W1/2：峰高一半處所對應(yīng)的峰寬

注：除了用于衡量柱效，還可以計算峰面積第34頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月6．分離度定義式分離度：相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍（衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)）討論：第35頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）分配系數(shù)和色譜分離分配系數(shù)和保留因子分配系數(shù)保留因子和保留時間的關(guān)系色譜分離的前提第36頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）基本術(shù)語1．保留時間tR：從進(jìn)樣開始到某組分色譜峰頂（濃度極大點）的時間，即組分在色譜柱中的停留時間或組分流經(jīng)色譜柱所需要的時間。

2．死時間t0或tm：分配系數(shù)為零的組分的保留時間，即組分在流動相中的停留時間或流動相流經(jīng)色譜柱所需要的時間（又稱流動相保留時間）。第37頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月3.分配系數(shù)K（平衡常數(shù)）：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數(shù)）注：K為熱力學(xué)常數(shù)與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動相性質(zhì)及溫度有關(guān)實驗條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)第38頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

4.保留因子（容量因子，容量比，分配比）k：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡時，在固定相與流動相中的質(zhì)量比——更易測定第39頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月5.保留比R’：衡量溶質(zhì)分子在色譜柱上相對移行速度第40頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）tR與K的關(guān)系：第41頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前討論：色譜條件一定時，tR主要取決K的大?。ㄉV法基本的定性參數(shù)）

K↑，tR↑，組分后出柱

K=0，組分不保留

K→∞，組分完全保留第42頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)論：色譜分離前提→各組分分配系數(shù)不等注：應(yīng)選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等2）色譜條件（s，m，T）一定時，K一定→tR一定1）組分一定，K不等的前提s和m改變

T改變第43頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)色譜法基本理論塔板理論速率理論第44頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月一、塔板理論色譜柱每個H高度內(nèi)有一塊塔板，共有若干塊塔板組分在每塊塔板兩相間分配達(dá)平衡，K小的先出柱多次分配平衡，K有微小差異組分仍可獲較好分離假想：第45頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）塔板理論的四個基本假設(shè)1．在柱內(nèi)一小段高度內(nèi)組分分配瞬間達(dá)平衡（H→理論塔板高度）2．分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)．3．流動相非連續(xù)而是間歇式（脈動式）進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)流動相一個塔板體積4．樣品和流動相均加在第0號塔板上，且忽略樣品沿柱方向的縱向擴散第46頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示第47頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）色譜峰的二項式分布（N較少）→逆流分布第48頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)移3次以后，3號塔板內(nèi)溶質(zhì)分?jǐn)?shù)第49頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示第50頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）色譜峰的正態(tài)分布（N>50次）→近似對稱分布討論：

第51頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）理論板數(shù)和理論塔板高度的計算

理論塔板高度H——為使組分在柱內(nèi)兩相間達(dá)到一次分配平衡所需要的柱長理論塔板數(shù)N——組分流過色譜柱時，在兩相間進(jìn)行平衡分配的總次數(shù)第52頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前第53頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前第54頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)1．塔板理論的貢獻(xiàn)：從熱力學(xué)角度解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大點的位置闡明了保留值與K的關(guān)系提出了評價柱效高低的n和H的計算式在比較相似柱的柱效時有用須在給定條件，指定組分測定時才有意義2．

第55頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月練習(xí)例：在柱長為2m的5%的阿皮松柱、柱溫為1000C，記錄紙速度為2.0cm/min的色譜條件下，測定苯的保留時間為1.5min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)。解：第56頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月二、速率理論

（一）塔板理論優(yōu)缺點（二）VanDeemteer方程式第57頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）塔板理論優(yōu)缺點成功處：解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大值對應(yīng)的tR

闡明了保留值與K的關(guān)系評價柱效（n，σ）存在問題:1）做出了四個與實際不相符的假設(shè)忽略了組分在兩相中傳質(zhì)和擴散的動力學(xué)過程2）只定性給出塔板高度的概念，卻無法解釋板高的影響因素3）排除了一個重要參數(shù)——流動相的線速度u，因而無法解釋柱效與流速關(guān)系更無法提出降低板高的途徑第58頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）VanDeemteer方程式吸收了塔板理論的有效成果——H，并從動力學(xué)角度較好地解釋了影響柱效的因素渦流擴散項縱向擴散項傳質(zhì)阻抗項第59頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月流速與柱效的關(guān)系第60頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1.渦流擴散項（多徑擴散項）：A

產(chǎn)生原因：載氣攜樣品進(jìn)柱，遇到來自固定相顆粒的阻力→路徑不同→渦流擴散next影響因素：固體顆粒越小，填充越實，A項越小討論：

注：顆粒太小，柱壓過高且不易填充均勻填充柱——60~100目空心毛細(xì)管柱（0.1~0.5mm），A=0，n理較高next第61頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示back第62頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2.縱向擴散項（分子擴散項）：B/u產(chǎn)生原因：峰在固定相中被流動相推動向前、展開→兩邊濃度差討論：

第63頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月3.傳質(zhì)阻抗項：C·u產(chǎn)生原因：組分分子與流動相和固定相分子相互作用的結(jié)果。樣品被流動相溶解擴散轉(zhuǎn)移的過程為傳質(zhì)影響因素：第64頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前討論：

注：固定液應(yīng)完全覆蓋載體表面，不可以太薄，否則柱子壽命短，k太?。?/p>

T不可以超過固定液最佳使用溫度小結(jié)：范氏方程說明了在色譜分離條件的選擇中，填充均勻程度、填充物的粒度、流動相的種類及流速、固定相的液膜厚度等對柱效和峰展寬的影響第65頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)色譜法的歷史與展望一、歷史：

30年代茨維特分離綠葉色素

40年代TLC，紙色譜

50年代GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能

60年代末HPLC出現(xiàn)，使色譜分析范圍進(jìn)一步擴大二、展望：

1．新型固定相和檢測器

2．聯(lián)用儀器：GC-MS，HPLC-MS3．智能化發(fā)展第66頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第67頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第十九章平面色譜法第一節(jié)平面色譜法的分類薄層色譜法紙色譜法薄層電泳法第68頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)薄層色譜法（一）概述（二）吸附劑的選擇（三）展開劑的選擇（四）定性參數(shù)（五）薄層板的制備（六）定性與定量分析第69頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）概述1．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法。2．操作過程：見圖示鋪板→活化

→點樣

→

展開

→定位(定性)/洗脫(定量)3．分離機制：吸附（分配，離子交換，空間排阻）4．特點：分析快速、靈敏、顯色方便5．應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定next第70頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示第71頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月圖示L0L1L2第72頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月分離原理

各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心

利用吸附劑表面的活性吸附中心對不同組分的

吸附能力差異而實現(xiàn)分離（二）常用吸附劑：多孔、微粒狀物質(zhì)

1.硅膠

2.氧化鋁

3.聚酰胺第73頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1.硅膠（SiO2·H2O）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

特性：

1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→強極性吸附中心，不易洗脫吸附活性次序：活潑型>束縛型>游離型

2）吸水→失活→105～110OC烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力適用：分析酸性或中性物質(zhì)

第74頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前2.氧化鋁堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁pH＞7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)3.聚酰胺氫鍵作用氫鍵能力↑強，組分越后出柱第75頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）吸附劑和流動相的選擇：

依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質(zhì)1.被測組分性質(zhì)（極性大?。?/p>

烴＜

--------＜羧酸，醇2.吸附劑的活性：吸附劑的活性↑大，對被測組分的吸附能力↑強

強極性物質(zhì)——選擇弱吸附劑弱極性物質(zhì)——選擇強吸附劑3.流動相的極性：流動相極性↑大，對被測組分的洗脫能力↑大“相似相溶”原則：根據(jù)組分性質(zhì)、吸附劑的活性，選擇適當(dāng)極性的流動相第76頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月吸附劑的選擇

根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力

被測物極性強——弱極性吸附劑

被測物極性弱——強極性吸附劑展開劑的選擇（同液固吸附色譜流動相的選擇）根據(jù)被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性第77頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月續(xù)前4.三者關(guān)系圖示：

組分吸附劑流動相極性活性小極性非(弱)極性