第三章培養(yǎng)基講義課件

第三章微生物用培養(yǎng)基及滅菌本章的主要內(nèi)容：

1、培養(yǎng)基的制備

2、starch的水解

3、培養(yǎng)基的滅菌§3-1培養(yǎng)基的制備及要求一、培養(yǎng)基用原材料及要求1、培養(yǎng)基原材料的要求（1）價格低廉，易得到（價格低，但不一定易得到，例如：地瓜干）（2）對微生物的生長繁殖和代謝無抑制作用的物質(zhì)（3）微生物的代謝產(chǎn)物無有害物質(zhì)。

2、培養(yǎng)基用原材料的種類碳源：

starch及其水解糖液含有starch及其水解產(chǎn)物的廢棄物：味精廢水、粉絲生產(chǎn)廢水等化工石油產(chǎn)品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等氮源：無機(jī)氮源：氨水、尿素(有脲酶的微生物)、(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl等，使用方式：有機(jī)氮源：豆粕、玉米漿、酵母粉、酵母浸出物、魚粉、菌體蛋白粉、玉米蛋白粉、牛肉膏等二、培養(yǎng)基的種類

按用途可分為：

生產(chǎn)培養(yǎng)基：厭氧發(fā)酵、需氧發(fā)酵、固體發(fā)酵種子培養(yǎng)基：搖瓶培養(yǎng)基（優(yōu)化工藝……）檢查培養(yǎng)基：

如：HASS發(fā)酵用的檢查培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂0.5%—0.55%、Sarch2%、Glucose0.5%平板培養(yǎng)后，根據(jù)透明圈的大小……

本章涉及到的培養(yǎng)基為：生產(chǎn)使用的培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基的制備1.培養(yǎng)基配制的原則（1）合適的C/N（2）在確定了C/N的前提下，需要研究的是不同的氮源對發(fā)酵的影響。（3）大多數(shù)的工業(yè)培養(yǎng)基都使用玉米漿。菌體的增殖速度有關(guān)與菌體細(xì)胞膜的合成有關(guān)，從而影響到細(xì)胞膜的通透性對于某些菌體，與代謝途徑和代謝機(jī)制有關(guān)。（4）生長因子大多數(shù)菌體的生長因子如下：維生素：大多數(shù)維生素是微生物生長的輔酶，需要量很少，1—50μg/L。AA：凡是微生物自身不能合成的AA則必須以游離的AA或者小分子的肽提供，通常，以小分子的肽提供，微生物更易通過細(xì)胞膜進(jìn)入菌體內(nèi)部?如果提供外援氨基酸，需要注意的是各種氨基酸的平衡。嘌呤及其衍生物2.培養(yǎng)基的優(yōu)化方法參考文獻(xiàn)：方開泰:均勻正交實(shí)驗(yàn)方法雄宗貴:發(fā)酵工藝學(xué)原理§3-2淀粉的水解一、淀粉水解的目的

許多微生物由于其本身的生理生化特性而決定了其代謝所需的底物只能是Glucose等單糖，主要有下列菌種：

酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、以及部分麥芽三糖等

細(xì)菌：GA產(chǎn)生菌、Lys產(chǎn)生菌、蘇云金芽孢桿菌等其中：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌則能夠直接以淀粉為原料。氨基酸產(chǎn)生菌不能……霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉為原料，他們本身具有淀粉的水解能力。二、淀粉的酸水解1、粉酸法水解的基本原理

淀粉是由葡萄糖通過α-1，4或α-1，6葡萄糖苷健連接而成的含有多個葡萄糖的大分子長鏈物質(zhì)，根據(jù)其葡萄糖連接的糖苷健的不同，可分為枝鏈淀粉和直鏈淀粉，可以使用重合度來表示淀粉分子的大小，所含有的葡萄糖苷健的數(shù)量，稱之為淀粉的重合度，用DP來表示。淀粉內(nèi)部的葡萄糖苷健在一定的溫度和酸性的條件下可以水解，而使淀粉分子鏈斷裂，高溫可加速葡萄糖苷健的水解速度。水解條件：高溫，120℃以上，H+,0.2MPa的壓力

2、酸法水解的特點(diǎn)

反應(yīng)條件比較強(qiáng)烈，水解速度快，產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，生產(chǎn)環(huán)境惡劣等。

主要有下列副產(chǎn)物：雙分子葡萄糖脫水，形成復(fù)合二糖，分別是異麥芽糖、龍膽二糖。前者不利于產(chǎn)物的結(jié)晶提出，后者對于菌體的生長有抑制作用。一分子葡萄糖脫水，形成5-羥甲基糠醛，對于菌體的生長有抑制作用。一分子葡萄糖和—NH2反應(yīng)，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物質(zhì)的主要來源。(美拉得反應(yīng))二、雙酶法1、兩種淀粉水解酶簡介：

α-淀粉酶；淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶

α-淀粉酶：

又稱為淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄糖苷健，其作用特點(diǎn)是可以快速將長鏈的淀粉水解成短鏈糊精，其水解速度隨著淀粉鏈長度的降低而變得越來越慢，換言之，該酶不可能將淀粉完全水解成葡萄糖（從水解葡萄糖苷健的種類，水解速度到最后已無工業(yè)意義三個方面），因此該酶的淀粉水解產(chǎn)物中以短鏈的糊精為主，含有少量的葡萄糖。液化的含義？

淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶：

又稱為糖化酶，可以水解淀粉分子的α-1，4；或α-1，6葡萄糖苷??；其作用特點(diǎn)：從淀粉的非還原性末端開始依次測切割葡萄糖，淀粉的分子鏈越短水解速度越快；水解產(chǎn)物為葡萄糖。2、酸法與雙酶法的優(yōu)缺點(diǎn)比較：

（1）酶促反應(yīng)條件溫和，水解產(chǎn)生的副產(chǎn)物少，對微生物的生長有利。（2）正因?yàn)樯鲜鲈颍矸鬯猱a(chǎn)率較高，通常糖的轉(zhuǎn)化率可以提高10%以上。這可以給味精、制藥的領(lǐng)域帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。例如：對于年產(chǎn)10000噸的小型味精廠，年增產(chǎn)100噸味精，直接經(jīng)濟(jì)效益可達(dá)到：

0.8×100=80萬元。（3）可以直接使用糧食進(jìn)行雙酶法水解，因?yàn)殡p酶法水解的條件溫和，對于糧食中的蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)的破壞較少。（4）雙酶法水解使用的淀粉乳濃度較高，可以達(dá)到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的濃度通常只有12Be，原因？（副產(chǎn)物）意義？（設(shè)備利用率）

液體濃度Be的概念λ因標(biāo)定的溫度不同可將波美表分為：美國：15.6℃標(biāo)定，λ=145

合理：15℃標(biāo)定，λ=144.3

荷蘭：12.5℃標(biāo)定，λ=144標(biāo)定方法：輕表：“0”Be的位置，把表放在一定溫度下的蒸餾水中的位置；“10”Be的位置，把表放在一定溫度下的比重為0.9351的溶液中的位置。重表：“0”Be的位置，該位置是把表放在一定溫度下的蒸餾水中；“66”Be的位置，該位置是把表放在一定溫度下的比重為1.842的濃硫酸溶液中。表示溶液的比重的方法還可以使用Bx(玻利克斯)：

定義：某一溶液的Bx，表示該溶液的比重和相同濃度（為Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。注意：Bx的概念不同于波美度，他與比重之間是沒有計算公式的，但是可以查找有關(guān)換算關(guān)系。3、淀粉的雙酶法水解工藝淀粉調(diào)漿→液化→糖化→過濾→糖液漿液濃度：20—30Be,調(diào)pH值6.0—7.0，添加CaCl2,使用量，0.01mol/L（目的？）液化：耐高溫α-淀粉酶，酶的使用量：5—8單位/g淀粉溫度：105℃；時間，20—30分鐘降溫：采用噴射冷卻方法：糖化：使用淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶；使用量：根據(jù)液化淀粉的濃度，30%的濃度，80—100單位/g淀粉溫度：65℃終點(diǎn)判斷：時間，2—3小時。4、雙酶法水解工藝流程簡介§2-3糖蜜的處理及工業(yè)添加劑一、糖蜜的主要成分1、糖，49—50%，因不同的原料和生產(chǎn)方法不同而異，主要是蔗糖2、膠體物質(zhì)，5—10%，來自于原料3、灰分，10—12%4、生物素，1—10mg/Kg(甘蔗)，0.04—0.06mg/Kg(甜菜)5、pH值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜）對于發(fā)酵工業(yè)可以利用得的主要成分是：糖和生物素

二、糖蜜的用途

發(fā)酵工業(yè)用原料，國內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)的有：味精、酵母……1、目前，國內(nèi)酵母工業(yè)使用進(jìn)口糖蜜為原料，帶來了較大的工業(yè)污染，……2、使用糖蜜生產(chǎn)酒精3、使用糖蜜生產(chǎn)蒸餾酒——姥姆酒，世界名酒，牙買加的國酒，在西方國家主要用于雞尾酒的勾兌上。4、作為添加劑使用，檸檬酸發(fā)酵，作為添加劑使用。5、使用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)黃源膠，已有研究報道。

三、糖蜜的處理方法1、處理目的a.除去膠體性物質(zhì)，降低糖蜜的粘度，提高發(fā)酵液的流動性，有利于改善發(fā)酵過程中氧的傳遞。b.脫色，除去有色物質(zhì)（有色物質(zhì)的來源？），對產(chǎn)品的質(zhì)量有影響，對微生物的生長和代謝有影響。

c.中和過量的酸堿性物質(zhì)，除去部分對pH值有影響的緩沖性物質(zhì)。

2、處理方法：a.冷酸通風(fēng)沉淀法，即加酸后，通風(fēng)，使之沉淀。b.加絮凝劑（PAM）工藝過程：

原溶液（稀釋）→40Bx→調(diào)pH值(3—3.8)→絮凝→靜置

↓

加熱到90℃

絮凝劑的用量：8mg/L，靜置時間：1小時

C.活性炭吸附法可以除去糖蜜中的有色物質(zhì)，明顯的降低糖蜜的色澤，對發(fā)酵的產(chǎn)品的提出和產(chǎn)品質(zhì)量有益。

四、工業(yè)培養(yǎng)基的添加劑添加劑通常是指除了培養(yǎng)基中的C、N、無機(jī)鹽、金屬離子以外的其它物質(zhì)，主要有：

1.前驅(qū)物質(zhì)

2.誘導(dǎo)劑代謝抑制劑

3.代謝抑制劑

1.前驅(qū)物質(zhì)特別是對于某些氨基酸、核苷酸和抗菌素的發(fā)酵生產(chǎn)，添加一定量的前驅(qū)物質(zhì)（前體）其作用是非常明顯的。

基本原理：（1）產(chǎn)物對前驅(qū)物質(zhì)的合成存在反饋抑制，需要添加前驅(qū)物質(zhì)產(chǎn)物對其不存在抑制或阻遏產(chǎn)物S前驅(qū)物質(zhì)（2）前驅(qū)物質(zhì)的合成效很低，需要添加前驅(qū)物質(zhì)。

（3）

x存在分枝代謝，形成產(chǎn)物p,而p不是目的產(chǎn)物，他又對x形成反饋抑制，不能夠很好的解決這個反饋抑制作用，須要有添加劑S前驅(qū)物質(zhì)產(chǎn)物S前驅(qū)物質(zhì)XP2.誘導(dǎo)劑代謝抑制劑

促進(jìn)劑主要是指誘導(dǎo)物，在酶的生產(chǎn)。3、代謝抑制劑

原理：有分枝代謝上的，如下圖所示：

抑制劑作用點(diǎn)，通常是X的結(jié)構(gòu)類似物，他的使用抑制了副產(chǎn)物（X）形成。抑制劑作用點(diǎn)SA產(chǎn)物副產(chǎn)物（X）CB

抑制劑主要在抗菌素的生產(chǎn)中使用的較多。（1）四環(huán)素發(fā)酵過程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物合成，從而提高四環(huán)素的產(chǎn)率。（2）頭孢霉素C，添加L—Met，可以抑制頭孢霉素N的生物合成，從而提高頭孢霉素C的產(chǎn)率。一、滅菌原理所謂滅菌就是殺死一切微生物，包括微生物的營養(yǎng)體和芽孢，這一概念不同于消毒。在工業(yè)生產(chǎn)中，對于培養(yǎng)基、管道、設(shè)備的滅菌，通常采用蒸汽加熱到一定的溫度，并保溫一段時間的滅菌方法，稱之為濕熱滅菌？濕熱滅菌的顯著優(yōu)點(diǎn)是：使用方便，無污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培養(yǎng)基中，也可以通過管道排出?！?-4培養(yǎng)基的滅菌關(guān)于滅菌的幾個基本概念：1.微生物的熱阻2.理論滅菌時間3.滅菌溫度的選擇1.微生物的熱阻

定義：微生物的熱阻就是指微生物對熱的抵抗能力。其對熱的抵抗能力越大，可以理解為熱阻越大，衡量不同的微生物對熱的抵抗能力的大小，可以使用相對熱阻的概念。

相對熱阻：兩種微生物的熱阻之比。例如：芽孢/大腸桿菌=3000000/1；病毒/大腸桿菌=1—5/1等2.理論滅菌時間滅菌過程應(yīng)遵循單分子反應(yīng)的速度理論：

-dN/dt=k*N式中

-dN/dt：表示滅菌過程中某瞬間活菌的減少速率

N：表示滅菌過程中某瞬間的活菌數(shù)

K：表示滅菌過程中菌體死亡的速度常數(shù)，

K=f(滅菌溫度、菌種、培養(yǎng)基等)上式的積分形式為：

t=2.303/k*lnN0/NS

式中

N0，NS：分別表示滅菌前、滅菌后培養(yǎng)基中菌體的濃度（個/ml）

k：意義同上

t：表示理論滅菌時間（秒）

理論滅菌時間的計算需要注意以下幾個問題：（1）K值因不同的微生物種類不同、不同的生理狀態(tài)、不同的外界環(huán)境，差別很大，實(shí)質(zhì)上，它是微生物熱阻的一種表示形式，微生物的熱阻越大，K值也越小。例如：芽孢，在121℃時，K=60/s

營養(yǎng)體，在121℃，k=60—6*1010/s

（2）在計算過程中，N0，NS如何取值？

（3）上述滅菌時間，通常稱之為理論滅菌時間，只可以用于工程計算中，在實(shí)踐過程中，因蒸汽的壓力問題（不穩(wěn)定）、蒸汽的流量問題有很大差別，甚至培養(yǎng)基中的固體顆粒的大小、培養(yǎng)基的粘度等因素，都會影響滅菌效果，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，通常采用經(jīng)驗(yàn)數(shù)值：間歇滅菌，121℃，20—30分鐘連續(xù)滅菌，137℃，15—30s，在維持罐中保溫8—20分鐘。3.滅菌溫度的選擇滅菌溫度的選擇應(yīng)考慮的因素主要有：

a.微生物的熱致死溫度，應(yīng)高于該溫度。通常以芽孢為準(zhǔn)。何為熱致死溫度？（10分鐘，全部死亡的溫度）

b.營養(yǎng)成分的破壞，滅菌的過程實(shí)質(zhì)上也是營養(yǎng)成分破環(huán)的過程因此，滅菌溫度的選擇，應(yīng)是在保證滅菌效果的前提下，盡可能減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的破壞。許多實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基在高溫滅菌的過程中，其營養(yǎng)成分的破壞在很大程度上可以用一級反應(yīng)來描述其反應(yīng)速度：

dc/dt=-K’×C式中

dc/dt：表示營養(yǎng)成分破環(huán)的速率

C：表示營養(yǎng)成分的濃度

K’：反應(yīng)速度常數(shù)，1/s，K=f(t,……)

反應(yīng)速度常數(shù)K’與反應(yīng)溫度的關(guān)系，可以使用阿累尼烏斯公式表示之：

K’=A’×e[-E/RT]……（1）式中

K’：反應(yīng)速度常數(shù)，1/SE：反應(yīng)的活化能（J/mol）

R：氣體常數(shù)，1.987*4.18J/mol*kT：反應(yīng)的絕對溫度，k同樣，滅菌過程中的反應(yīng)速度常數(shù)也可以用阿累尼烏斯公式表示之：K=A×exp[-E/RT]……（2）（1）、（2）式可以改寫成下列形式：

lg(k’2/k’1)=E’/R×(1/T1–1/T2)……（3）

lg(k2/k1)=E/R×(1/T1–1/T2)……（4）（3）、4）的意義是指：反應(yīng)的溫度從T1

升高到T2

，營養(yǎng)成分破壞反應(yīng)的速度常數(shù)分別從k’1

增加到k’2；菌體死亡的速度常數(shù)從k1

增加到k2培養(yǎng)基的滅菌過程實(shí)際上是營養(yǎng)成分破壞、菌體死亡的兩個平行性反應(yīng)，如下所示：

對于平行性反應(yīng)，反應(yīng)溫度的提高，其兩個平行性反應(yīng)的速度常數(shù)都增加，但增加的幅度（大小）卻不同，其比值可以表示為：

lg(k2/k1)/lg(k’2/k’1)=E/E’……(5)

E’=8.36—83.6kJ/mol

芽孢：E=418kJ/mol

無芽孢：E=209—250kJ/molC

BA

二、培養(yǎng)基的工業(yè)滅菌方法

培養(yǎng)基的工業(yè)滅菌通常涉及到以下幾個概念：1.空消:

意義：由于空消時反應(yīng)器內(nèi)的死角少，蒸汽的傳熱效率高，對于反應(yīng)器滅菌效果好，通常在較長時間沒有使用的反應(yīng)器、染菌的反應(yīng)器、更換菌種時都要進(jìn)行空消。采用培養(yǎng)基連續(xù)滅菌的工藝，需要空消。2.實(shí)消：定義？優(yōu)點(diǎn)：不需要特定的設(shè)備，操作、管理比較靈活。3.連消：定義？優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分破壞少，生產(chǎn)效率高熱綜合利用率高大型企業(yè)自動化程度高盡管，高溫短時滅菌的優(yōu)點(diǎn)非常明顯，但不能說發(fā)酵領(lǐng)域采用高溫短時滅菌是唯一的選擇。一個生產(chǎn)企業(yè)滅菌方法的選擇是要從生產(chǎn)工藝、設(shè)備、操作、技術(shù)管理、固定資產(chǎn)投資等多個方面整體考慮。目前，我國發(fā)酵領(lǐng)域仍然是以分批操作的實(shí)消為主，因此我們的后述內(nèi)容主要是介紹分批操作的實(shí)消滅菌工藝。

三、分批滅菌操作要點(diǎn)將配置好培養(yǎng)基打入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行實(shí)消，操作要點(diǎn)如下：1、定期檢查設(shè)備、管道有無滲漏，主要是：冷卻管道，夾套。2、培養(yǎng)基升溫時，打開所有的排氣閥門，排掉空氣？當(dāng)培養(yǎng)基的溫度升到滅菌溫度時，進(jìn)入保溫操作階段，此時要求與反應(yīng)器相連的所有管道出于兩個狀態(tài)：進(jìn)汽或出汽，目的是對管道進(jìn)行滅菌。3、培養(yǎng)基升溫時開動攪拌系統(tǒng)，以使培養(yǎng)基內(nèi)部傳熱均勻，當(dāng)溫度升溫到100℃時，停止攪拌，一方面是為了保護(hù)軸承，另一方面，當(dāng)培養(yǎng)基的溫度升溫到100℃時，培養(yǎng)基的沸騰，可以起到攪拌作用。分批滅菌操作要點(diǎn)4、注意輔助設(shè)備的滅菌：空氣過濾器、計量罐、流加管道與流加液貯罐，空氣流量計等。5、保溫期間，要求罐壓：0.09—0.10MPa，溫度：118—121℃，時間：30分鐘。6、滅菌結(jié)束后，需要立即引入無菌空氣，保證罐內(nèi)壓力后方可冷卻，目的是防止培養(yǎng)基的冷卻使罐內(nèi)形成負(fù)壓，易染菌。7、配制培養(yǎng)基時，應(yīng)充分考慮培養(yǎng)基在滅菌時的稀釋（體積的增加），通常體積可增加20%左右，滅菌時間越長，體積增加的越多。四、分批滅菌的工程計算1.升溫階段（1）使用夾套、冷卻排管

t=W*C/K*F×ln(t1–t2s)/(t1–t2f)

式中t：升溫所需要的時間（小時）

W：培養(yǎng)基的重量，（kg）

F：總的傳熱面積，m2t1：加熱蒸汽的溫度，℃t2s：培養(yǎng)基加熱的起始溫度，℃t2f：培養(yǎng)基滅菌的溫度，℃k：平均傳熱系數(shù)，kJ/m2·h·℃

夾套加熱：k=830—1254kJ/m2·h·℃

排管加熱：k=1254—1881kJ/m2·h·℃C：培養(yǎng)基的比熱，kJ/kg·℃

比熱C的計算方法：采用線性疊加法：

C=0.37×4.18×X+4.18×（1-X）醪液中固形物的重量百分?jǐn)?shù)%0.37×4.18：固形物的比熱，kJ/kg·℃

任何以谷物、淀粉為原料的醪液，其比熱都可以這樣計算。（2）蒸汽直接加熱

加熱的速度很快，