蔗糖酶純化電泳

題目：聚丙烯酰胺凝膠電泳分離測(cè)定蔗糖酶純度班級(jí)： 食品質(zhì)量與安全班 日期：4月10日姓名：_雷灼貴—9號(hào)_小組成員：第11、13、15 實(shí)驗(yàn)臺(tái)號(hào)：_9號(hào)_ 教師評(píng)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理，掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳分離測(cè)定蔗糖酶純度的操作方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acrylamide,簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯酰胺（Methylence-bisacry-lamide,簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）在催化劑和加速劑的作用下聚合交聯(lián)形成的具有分子篩效應(yīng)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。凡以此凝膠為支持物的電泳均稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE）o凝膠篩孔大小、機(jī)械強(qiáng)度和透明度等物理參數(shù)，主要取決于凝膠濃度T%）及交聯(lián)度（C%）,隨著這兩個(gè)參數(shù)的改變，可獲得對(duì)待測(cè)分子進(jìn)行分離、分辨的最適孔徑。丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)。在連續(xù)系統(tǒng)中緩沖溶液H值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下主要靠電荷及分子篩效應(yīng)得以分離；而在不連續(xù)系統(tǒng)中，不僅具有前兩種效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，使電泳具有良好的清晰度和分辨率。電泳時(shí)樣品的濃縮效應(yīng)主要由以下原因產(chǎn)生：（1）凝膠孔徑的不連續(xù)。在不連續(xù)的PAGE中，電泳凝膠由上下兩層不同pH、不同孔徑的濃縮膠和分離膠組成，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔的濃縮膠中泳動(dòng)的速度快，當(dāng)進(jìn)入小孔分離膠時(shí)，其泳動(dòng)過(guò)程受阻，因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的這種不連續(xù)性造成樣品位移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。（2）緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性。在Tris-甘氨酸緩沖體系中，各膠層中均含有HCl,HCl在任何pH溶液體系中均容易離解出CL,它在電場(chǎng)中遷移率最大；甘氨酸等電點(diǎn)為6.0，在pH6.8的濃縮膠中，離解度很低，僅有。.瞄1%的NH2CH2C。。-,因而在電場(chǎng)中的遷移速度很慢；大部分蛋白質(zhì)p】在5.0左右*此電泳環(huán)境中都以負(fù)離子形式存在。通電后，這三種負(fù)離子在濃縮膠中都向正極移動(dòng)而且它們的泳動(dòng)率按mdach>mpap>mqaq排序（有效遷移率等于遷移率m與離解度a的乘積）。于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處:被壓縮成極窄的區(qū)帶。（3）是由電位梯度的不連續(xù)性所至。電泳開(kāi)始后，由于Cl_-的遷移率最大,很快超過(guò)蛋白質(zhì)，因此在快離子后面，形成一個(gè)離子濃度低的電導(dǎo)區(qū)，由此產(chǎn)生一個(gè)高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢甘氨酸離子在快離子后面加速移動(dòng)，當(dāng)快離子和慢離子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，由于蛋白質(zhì)的有效遷移率正好介于快、慢離子之間而被濃縮形成一狹小的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，凝膠pH變?yōu)?.8，此時(shí)甘氨酸解離度大大增加，其有效遷移率也因此加大，并超過(guò)所有蛋白質(zhì)分子。這樣，快慢離子的界面（由漠酚藍(lán)指示劑標(biāo)記）總是跑在被分離的蛋白質(zhì)樣品之前，不再存在不連續(xù)的高電勢(shì)梯度區(qū)域。于是，蛋白質(zhì)樣品在一個(gè)均一的電勢(shì)梯度和均一的）H條件下，通過(guò)凝膠的分子篩作用，根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷不同，具有不同遷移率而達(dá)到分離目的。三、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容樣品上樣及樣品電泳1.1上樣體積30微升。1.2樣品名稱(chēng)：自溶酶液、上樣酶液、過(guò)柱收集酶液（2-1、2-2、2-3、2-4）、牛血清蛋白。1.3上樣完畢，正確連接電泳槽與電泳儀的正負(fù)極，選擇28mA恒定電流，開(kāi)始電泳。并記錄初始電壓。1.4當(dāng)漠酚藍(lán)指示液離凝膠片的瓊脂層1.5cm左右時(shí)電泳結(jié)束，關(guān)閉電源。記錄終止電泳電壓。1.5在老師的指導(dǎo)下，進(jìn)行凝膠片與玻璃板的分離1.6凝膠片染色與脫色（老師完成）練習(xí)凝膠板的制備（利用電泳空余時(shí)間）2.1電泳槽安裝2.2灌膠（配制8%凝膠濃度的分離膠和4%凝膠濃度的濃縮膠 ）2.3灌膠2.3.1分離膠制備：將配制好的分離膠，連續(xù)緩慢地沿長(zhǎng)玻璃板板壁注入凝膠模，直至膠液的高度達(dá)到低玻璃板板面 2/3左右，用注射器小心流加入2cm左右高度的雙蒸水覆蓋膠面，其加水速度應(yīng)控制在不破壞膠層分度。約60min左右后,當(dāng)凝膠與水層間出現(xiàn)折射率不同的分層面時(shí)，表明凝膠聚合完成。傾去膠層蒸餾水，再用雙蒸水洗滌膠面，以除去未聚合膠液，并用濾紙吸干多余的水。2.3.2濃縮膠置備：用微量的未加TEMED的濃縮膠洗滌分離膠面一次，傾去洗滌用的濃縮膠液，用濾紙吸干多余的膠液。然后將配好的濃縮膠連續(xù)緩慢加到已聚合的分離膠的上方，直至距離短玻璃板上緣約1mm處為止，隨后將樣品槽梳子輕輕插入濃縮膠內(nèi)。待凝膠聚合后，小心拔出槽梳板，注意不要弄斷或弄裂膠層。用長(zhǎng)針頭輕而有序地將每個(gè)凹形樣品槽修飾整理，加雙蒸水清洗槽坑，最后用針筒抽干凹槽內(nèi)的雙蒸水。四、 數(shù)據(jù)記錄4.1樣品電泳時(shí)電壓變化時(shí)間（min）電壓（V）時(shí)間（min）電壓（V）018440294102084531615216503462022455372252386040830252654303527066434

備注：2號(hào)自溶酶液 ； 3號(hào)上樣酶液； 4、10號(hào)過(guò)柱收集酶液2-15、11號(hào)過(guò)柱收集酶液2-2 ;6、7號(hào)過(guò)柱收集酶液2-38號(hào)過(guò)柱收集酶液2-4、 ;9號(hào)牛血清蛋白五、數(shù)據(jù)處理與分析5.1樣品電泳時(shí)間與電壓的關(guān)系結(jié)論：由樣品電泳時(shí)間與電壓的關(guān)系圖可以看出恒流條件下進(jìn)行電泳電泳儀的電壓與樣品電泳的時(shí)間符合一定的線(xiàn)性,即隨著電泳時(shí)間的增長(zhǎng)，電壓線(xiàn)性增加。5.2.1上柱酶液（3號(hào)）與自溶酶液蛋白質(zhì)（2號(hào)）組分比較，有較好的純化效果，蛋白帶有減少，即表明部分雜蛋白去除。5.2.2從葡聚糖凝膠柱層析收集的酶液樣品與上柱酶液樣品蛋白質(zhì)組成比較中，過(guò)柱收集酶液2-1，（即洗脫峰一的前半段峰收集濃縮液，4號(hào)）分子量為較大的組分，蛋白質(zhì)條帶只有上柱酶液（3號(hào)）分子量大的條帶，即其在圖中條帶的上部分。過(guò)柱收集酶液2-2（即洗脫峰一的后半段峰收集濃縮液，5號(hào)）分子量為相對(duì)較小的部分，其蛋白質(zhì)條帶為上柱酶液（3號(hào)）蛋白質(zhì)條帶的中間部分。柱收集酶液2-3（即洗脫峰二收集濃縮液，6、7號(hào)）由于上樣樣品蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)條紋不清晰，但仍可較模糊地看到在分子量小的部位，及凝膠中下方有模糊的條帶，表明該樣品的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量集中于較小的部分，而且相對(duì)清晰的條帶只有一條，更能表明此組分純化程度很高。5.2.3牛血清蛋白分子量為68kD，電泳圖譜中牛血清蛋白（9號(hào)）出現(xiàn)三條蛋白質(zhì)條帶，可能原因是牛血清蛋白同時(shí)以單體（68kD），二聚體（136kD）和三聚體（204kD）的形式存在。上柱酶液（3號(hào)）與自溶酶液蛋白質(zhì)（2號(hào)）各個(gè)組分的分子量均有分布。過(guò)柱收集酶液2-1蛋白質(zhì)組分的分子量主要集中在160kD，且在分子量在160kD以下的蛋白質(zhì)條帶十分模糊，可認(rèn)為基本上沒(méi)有蛋白質(zhì)條帶分布。過(guò)柱收集酶液2-2蛋白質(zhì)組分的分子量也主要集中在160kD，但在136kD以下有一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，而且比2-1少了兩條分子量最大的蛋白質(zhì)條帶。過(guò)柱收集酶液2-3蛋白質(zhì)條帶主要集中在120kD，只有一條比較模糊的條帶。電泳圖譜5.2.4葡聚糖凝膠柱G-200對(duì)球型蛋白的有效分離范圍為5x1036x105，根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)電泳圖譜中上樣酶液的相對(duì)分子質(zhì)量分布，即主要集中在160kD，同時(shí)對(duì)于我們的目的蛋白質(zhì)，根據(jù)上次樣品的酶活力測(cè)定結(jié)果，過(guò)柱收集酶液2-1酶比活力最低位37.23U/mg，2-2為53.14U/mg,2-3為98.63U/mg，可初步估計(jì)我們的目的蛋白為過(guò)柱收集酶液2-3出現(xiàn)的蛋白質(zhì)條帶，分子量約為120kD。凝膠柱層析純化時(shí)應(yīng)選用分辨率更高的葡聚糖凝膠柱G-150，其對(duì)球蛋白的有效分離范圍為5X1033X105或者分辨率更高的葡聚糖凝膠柱G-100，其對(duì)球蛋白的有效分離范圍為5x1031.5X105。這樣經(jīng)過(guò)層析柱純化后，各組分蛋白質(zhì)分離純化效果將更好。六、總結(jié)與反思對(duì)于電泳譜圖，6、7號(hào)上樣樣品蛋白質(zhì)含量過(guò)少，而2號(hào)上樣樣品蛋白質(zhì)含量過(guò)多，導(dǎo)致這三個(gè)樣跑出來(lái)的圖譜都不清晰，應(yīng)根據(jù)各樣品的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)其進(jìn)行濃縮或者稀釋?zhuān)沟鞍踪|(zhì)濃度達(dá)到3-5ul/ml。本次實(shí)驗(yàn)在練習(xí)凝膠板制備時(shí)，經(jīng)歷了兩次失敗。均由于操作的失誤。第一次為未將電泳槽垂直板安裝，將凝膠模放置于其中，讓其保持垂直，并將其壓緊。而我們是直接將凝膠模隨便放置在桌面，未保持垂直，更未讓凝膠模壓緊，從而導(dǎo)致了灌膠時(shí)的大量漏液。第二次重做時(shí)，由于在時(shí)間的問(wèn)題，為了加快濃縮膠凝固的時(shí)間，我們加多了一倍的TEMED，但是由于我們組員使用微量注射器進(jìn)行添加TEMED時(shí)，未注意注射器里面有氣體，導(dǎo)致原本加入80ul體積TEMED，變?yōu)橹患恿藥譽(yù)lTEMED，使凝膠的時(shí)間變得更加長(zhǎng)。從中，我們更加深刻的明白，實(shí)驗(yàn)是很容易失敗的。只有更多的去了解、理解、熟悉實(shí)驗(yàn)，第一次成功的幾率才會(huì)高，而想要做的更加好，只有不斷地重復(fù)實(shí)驗(yàn)，而且每次重復(fù)前，好好對(duì)上一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)。七、思考題根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，做好電泳實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟有哪些？答：凝膠制備好。第一，凝膠玻璃板須徹底清洗干凈；第二，密封條（瓊脂）要封好，不能漏水； 第三，灌膠時(shí)不能有氣泡產(chǎn)生，否則會(huì)影響后面凝膠的效果。上樣樣品蛋白質(zhì)濃度，不可過(guò)高或者過(guò)低，應(yīng)控制在蛋白質(zhì)濃度達(dá)到3-5ul/ml。同時(shí)各上樣體積加入量也許適宜，一般為上樣孔體積三分之一為宜，而且要盡量保