茶樹嘌呤生物堿分解代謝關(guān)鍵基因功能驗證及其調(diào)控機制研究

低咖啡因茶樹品種是實現(xiàn)低咖啡因茶和茶產(chǎn)品高效、安全生產(chǎn)的根本保證，但目前低咖啡因茶樹資源嚴重不足，咖啡因等嘌呤生物堿(PAs)分解代謝調(diào)控機制不明是造成低PAs積累茶樹資源創(chuàng)新進展緩慢的重要原因之一。本項目擬通過對不同成熟度葉片轉(zhuǎn)錄組測序和差異基因分析基礎(chǔ)上，獲得茶樹PAs分解代謝途徑相關(guān)候選基因，利用原核和真核表達系統(tǒng)驗證PAs分解相關(guān)關(guān)鍵候選基因生物學功能，分析生理和環(huán)境因子對相關(guān)目的基因表達活性的影響，研究目的基因啟動子特性、表達活性、編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性與不同茶樹品種PAs積累關(guān)系，明確茶樹PAs分解代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控機制。為低PAs積累轉(zhuǎn)基因茶樹新資源培育開辟新途徑，也可為茶樹PAs高效降解新技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。中文摘要(對項目的背景、主要研究內(nèi)容、重要結(jié)果、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及其科學意義等做簡單概述)低咖啡因茶樹品種是實現(xiàn)低咖啡因茶和茶產(chǎn)品高效、安全生產(chǎn)的根本保證。咖啡因合成和降解途徑的消長決定了其在茶葉中的含量，目前茶葉咖啡因合成途徑涉及的主要酶類和基因都已明晰，但降解途徑關(guān)鍵基因及調(diào)控機制尚不明確，該瓶頸已成為開展低咖啡因茶樹資源創(chuàng)新與評價最重要的限制因素之一-。本研究在茶、苦茶和茶X苦茶雜種不同成熟度葉片轉(zhuǎn)錄組和嘌呤生物堿代謝物分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合WGCNA關(guān)聯(lián)研究，獲得了茶資源咖啡因降解關(guān)鍵候選基因CYP82D471.2;序列分析顯示，該基因開放閱讀框長1560bp，編碼519個氨基酸殘基、分子量^58.5kD、具2個跨膜區(qū)的細胞色素P450蛋白，且苦茶與茶X苦茶雜種之間氨基酸序列相似性為99.6%，顯著高于茶與苦茶、茶與茶X苦茶雜種之間的相似性;通過原生質(zhì)體瞬時表達、外源基因異源表達以及反義寡核苷酸注射技術(shù)，探明了CYP82D471.2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、參與咖啡因到苦茶堿的催化過程;經(jīng)嘌呤生物堿代謝途徑相關(guān)基因表達與代謝物含量關(guān)聯(lián)分析，明確了茶、苦茶和茶X苦茶雜種嘌呤生物堿積累模式差異主要受CYP82D471.2基因等表達水平調(diào)控，而做青等逆境條件下茶葉嘌呤生物堿含量變化影響因素較復雜;經(jīng)克隆和比對，明晰了茶、苦茶和茶X苦茶雜種CYP82D471.2基因啟動子序列及順式作用元件，并初步揭示不同茶資源中該基因的差異表達可能與啟動子中925th~-818th和--361st~--301st處的SNPs有關(guān)。研究成果為全面揭示CYP82D471.2催化機理以及在不同茶資源嘌呤生物堿積累中的調(diào)控作用奠定了重要基礎(chǔ)，同時也為利用該基因進行茶資源評價、種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)開發(fā)和低咖啡因品種選育創(chuàng)造了良好條件。因此，本項目研究意義顯著，應用前景廣闊。(一)結(jié)題報告1.研究計劃執(zhí)行情況概述1.1計劃執(zhí)行情況開展了茶、可可茶、苦茶以及茶X苦茶雜種茶資源葉片中嘌呤生物堿鑒定和分析，實施了茶、苦茶和茶X苦茶雜種不同成熟度葉片轉(zhuǎn)錄組測序和差異基因分析，采用WGCNA關(guān)聯(lián)分析獲得茶樹咖啡因分解代謝途徑關(guān)鍵候選基因;采用RT-PCR技術(shù)克隆了茶、苦茶和茶X苦茶雜種中的關(guān)鍵候選基因，采用生物信息軟件比較了三種茶資源中候選基因序列及其編碼產(chǎn)物特性差異;利用原核和真核表達以及反義寡核苷酸技術(shù)對關(guān)鍵候選基因進行了功能解析，完成了茶、苦茶和茶X苦茶雜種目的基因啟動子克隆和序列比對、以及調(diào)控元件分析,.開展了茶、苦茶和茶X苦茶雜種不同發(fā)育階段葉片嘌呤生物堿代謝物及其相關(guān)代謝途徑基因表達強度關(guān)聯(lián)研究，比較了不同茶樹品種不同做青階段樣品中生物堿含量和代謝途徑基因表達水平差異。本項目已按計劃實施所有研究內(nèi)容。1.2研究目標完成情況研究目標已按計劃完成。具體為:篩選獲得了茶及其近緣種嘌呤生物堿降解相關(guān)關(guān)鍵基因CYP82D471.2,該基因開放閱讀框長1560bp、編碼519個氨基酸殘基,CYP82D471.2分子量約為58.5kD、具有2個跨膜區(qū);發(fā)現(xiàn)CYP82D471.2在苦茶、茶X苦茶雜種中相似性達到99.6%，但與茶存在50個氨基酸位點差異;探明了CYP82D471.2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、參與咖啡因到苦茶堿的催化過程;明確了茶、苦茶和茶X苦茶雜種不同發(fā)育階段葉片積累不同嘌呤生物堿主要與CYP82D471.2基因的差異表達密切相關(guān)，而做青等逆境條件下茶葉嘌呤生物堿的變化影響因素較多;獲得了茶、苦茶和茶X苦茶雜種CYP82D471.2啟動子序列及順式作用元件，初步探明不同茶資源中該基因的差異表達可能與啟動子中-925~-818h和-3615t~-3015t處的SNPs有關(guān)。本研究為進-步深入探明CYP82D471.2催化及其調(diào)控機制奠定了重要基礎(chǔ)，同時也為利用該基因進行茶樹資源評價、品種改良技術(shù)開發(fā)和低咖啡因品種選育創(chuàng)造了良好條件。在本研究中,由于篩選獲得的咖啡因降解基因CYP82D471.2編碼產(chǎn)物為膜結(jié)合蛋白，而且催化反應還需要P450還原酶(CPR)和NADP+等輔助因子，因此在基因功能解析過程中，嘗試了多種原核表達載體以及去除膜結(jié)合區(qū)等多種手段均未能檢測到酶活性,還利用畢赤酵母系統(tǒng)開展了CYP82D471.2與CPR串聯(lián)表達研究，因表達量低未能驗證該基因功能。之后，在檢索大量文獻后，嘗試采用注射反義寡核苷酸方法，結(jié)合表達量和嘌呤生物堿分析，證明了CYP82D471.2主要參與咖啡因到苦茶堿的催化過程?？梢?，在基因功能解析過程中，在原計劃的基礎(chǔ)上增加了反義寡核苷酸注射實驗，實現(xiàn)了研究目標。2.研究工作主要進展、結(jié)果和影響2.1主要研究內(nèi)容①開展了茶(‘福鼎大白茶’)、可可茶、苦茶和茶X苦茶雜種(‘凌云白毫’)葉片嘌呤生物堿代謝物鑒定，明確了四種茶資源不同成熟度葉片嘌呤生物堿組成特點;完成了‘福鼎大白茶’、苦茶和‘凌云白毫’不同嫩度葉片轉(zhuǎn)錄組分析研究，結(jié)合WGCNA關(guān)聯(lián)分析篩選獲得了咖啡因降解關(guān)鍵候選基因CYP82D47ls。②克隆了‘福鼎大白茶’、苦茶和‘凌云白毫’CYP82D471.1.CYP82D471.2.和CYP82D471.3基因，發(fā)現(xiàn)CYP82D471.2基因編碼區(qū)在三種茶資源間差異顯著，且苦茶與‘凌云白亳’氨基酸序列相似度最高，結(jié)合qPCR分析確定CYP82D471.2與苦茶和‘凌云白毫’葉片咖啡因降解產(chǎn)物苦茶堿生成關(guān)系最為密切。③利用原生質(zhì)體瞬時表達以及原核表達、真核表達和反義寡核苷酸技術(shù)，開展了CYP82D471.2基因功能解析和亞細胞定位研究,明確了CYP82D471.2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與咖啡因到苦茶堿的催化過程。④開展了CYP82D471.2啟動子克隆及其調(diào)控元件分析，初步明確了引起‘福鼎大白茶’、苦茶和‘凌云白毫’基因差異表達的啟動子區(qū)段;分析了不同生長階段葉片以及做青逆境條件下嘌呤生物堿代謝相關(guān)基因表達水平與代謝物含量，證明具有不同嘌呤生物堿積累特性的茶資源嫩葉、成熟葉和老葉中苦茶堿含量與CYP82D471.2基因表達水平存在高關(guān)聯(lián)性，該基因可用作茶資源篩選和育種評價的指標;做青等逆境條件下茶樹葉片嘌呤生物堿含量變化除了受到相關(guān)基因表達調(diào)控外，可能還受基因翻譯和酶原激活等多種因素影響。2.2取得的主要研究進展及其科學意義2.2.1.茶及近緣種嘌呤生物堿代謝物組成研究2.2.1.1茶及近緣種嘌呤生物堿代謝物鑒定分別采收‘福鼎大白茶’(茶樹Camelliasinensis)、可可茶(Camelliaptilophylla)、苦茶(Camelliakucha)和‘凌云白亳’(茶x苦茶雜種)嫩葉和成，熟葉，經(jīng)微波殺青后80°C烘干制成固定樣，采用100°C熱水浸提、聚乙烯吡咯烷酮沉淀去除多酚、二氯甲烷萃取、氮氣吹干等步驟制備了上述樣品中的嘌呤生物堿代謝物粗品。經(jīng)UPLC-DAD-MS/MS分析，‘福鼎大白茶'葉片中含有高豐度的咖啡因和可可堿，同時可檢測到的少量的苦茶堿以及痕量的茶堿、尿囊素和甲基尿囊素;在可可茶中可檢測到可可堿、咖啡因和尿囊素，其中可可堿豐度最高;在苦茶中含有苦茶堿、咖啡因、可可堿、苦茶堿氧化物和甲基尿囊素等，其中苦茶堿豐度最高;在‘凌云白亳’葉片中，含有較高豐度的苦茶堿和咖啡因，少量苦茶堿氧化物、可可堿，以及痕量的茶堿、甲基尿酸、二甲基尿酸、三甲基尿酸、甲基尿囊素和三甲基尿囊酸(表1)?？梢?，‘凌云白毫’與苦茶、‘福鼎大白茶’的嘌呤生物堿代謝物組成較為接近，而與可可茶差異較大。2.2.1.2.茶及近緣種不同成熟度葉片嘌呤生物堿含量變化規(guī)律比較了'福鼎大白茶’、‘凌云白毫’、可可茶、苦茶不同葉齡(1W-45W)葉片中主要生物堿含量，結(jié)果顯示，隨著葉齡增加，‘福鼎大白茶'葉片中咖啡因和可可堿呈顯著下降趨勢，苦茶堿有增加趨勢，茶堿變化不明顯;可可茶葉片中可可堿和咖啡因也隨葉齡增加而下降;苦茶葉片中苦茶堿隨葉齡增加呈先增后降趨勢，咖啡因和可可堿隨葉齡增加而顯著下降，而苦茶堿氧化物則持續(xù)增加;‘凌云白毫’葉片中，咖啡因、可可堿隨葉齡增加而顯著下降，但苦茶堿和苦茶堿氧化物則呈增加趨勢，茶堿變化不明顯(表2)?？梢?，在普通茶樹成熟葉和老葉中中,咖啡因分解代謝較快，且至少有部分是通過N-9甲基化和C-8氧化途徑進行;在苦茶中，合成的咖啡因絕大部分通過N-9甲基化和C-8氧化快速轉(zhuǎn)化為苦茶堿，并在老葉中被較快代謝掉;而在*凌云白毫'中，呈現(xiàn)明顯的咖啡因與苦茶堿消長關(guān)系，且老葉中積累的苦茶堿較難進一步分解掉(圖1)。由此可見，‘福鼎大白茶’、‘凌云白毫'和苦茶的嘌呤生物堿代謝差異顯著、特色鮮明，是相關(guān)代謝途徑和關(guān)鍵基因挖掘研究的合適材料。2.2.2.茶及近緣種葉片轉(zhuǎn)錄組分析及咖啡因降解關(guān)鍵基因篩選2.2.2.1茶及近緣種不同成熟度葉片轉(zhuǎn)錄組和差異基因分析提取*福鼎大白茶’、‘凌云白毫'和苦茶不同葉齡樣品RNA，進行轉(zhuǎn)錄組測序，每個樣品可獲得6.2G以上的原始數(shù)據(jù)，且Q30均大于91%，說明測序質(zhì)量較好。以Cutadapt去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，并以HISAT2進行比對，每個樣品可得到3.8G以上可分析數(shù)據(jù)，能比對到參考基因組的基因區(qū)數(shù)據(jù)占比為67.8%-82.6%，比對到基因外顯子區(qū)的數(shù)據(jù)占比為93.6%-98.3%(表3)。根據(jù)篩選標準q值<0.005&log2(Foldchange)>1|，篩選出6839條差異表達基因(DEGs)(圖2)。在*福鼎大白茶’、‘凌云白毫’和苦茶中，從嫩葉到成熟葉階段DEGs數(shù)目最多、且下調(diào)基因數(shù)明顯高于上調(diào)基因數(shù)(表4)，其中*福鼎大白茶’下調(diào)表.達基因為2753個、上調(diào)基因數(shù)為1886個、‘凌云白毫'下調(diào)基因數(shù)為2453個、上調(diào)基