豬apobec3f基因多態(tài)性及其與prrsv易感性相關(guān)性分析

豬apobec3f基因多態(tài)性及其與prrsv易感性相關(guān)性分析

脂蛋白質(zhì)bmrna編輯酶催化多邊形3f（apobec3f）是apobec家族的成員。它具有廣泛的抗炎性，可以有效地抑制人類免疫缺陷（hiv）、肝炎（hbv）、豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)率病毒（perv）等病毒的復(fù)制，在對肝臟疾病和自然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究結(jié)果表明APOBEC3F基因的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒特性具有普遍性1材料和方法1.1豬目的組織制備試驗豬包括9個品種,共193頭,其中杜洛克豬36頭(購自杭州大關(guān)豬場)、長白豬42頭(購自杭州大關(guān)豬場)、大白豬38頭(購自杭州大關(guān)豬場)、蘇鐘豬34頭(購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)基地豬場)、姜曲海豬14頭(購自江蘇姜曲海豬場)、定遠(yuǎn)豬12頭(購自安徽定遠(yuǎn)縣豬場)、二花臉豬5頭(購自江蘇省常熟市畜禽良種有限責(zé)任公司)、梅山豬5頭(購自江蘇太倉市種豬場)、三元雜交豬7頭(購自鎮(zhèn)江丹徒區(qū)云立牧業(yè)有限公司)。每個個體取耳組織于凍存管中,置于液氮中保存。PRRSVNJGC株由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所提供。1.2方法1.2.1溫度復(fù)性法耳組織樣的DNA提取采用酚/氯仿抽提法,TEbuffer溶解后,-20℃保存。PCR反應(yīng)程序:98℃變性10s;各引物最適溫度復(fù)性5s,72℃延伸1min20s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠(EB)染色,檢測擴(kuò)增結(jié)果。1.2.3pcr擴(kuò)增及測序每6頭豬DNA等量混合構(gòu)建DNA池,構(gòu)建3個不同的DNA池,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳純化后的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。1.2.4pcr產(chǎn)物的酶切分型根據(jù)測序結(jié)果選擇外顯子8的5bp處的多態(tài)位點,建立PCR-RFLP檢測方法,引物Nrul-SNP序列見表1。PCR反應(yīng)總體系20.0μl,含模板DNA60ng,Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl,dNTPs(10mmol/L)0.4μl,上、下游引物(10μmol/L)各0.6μl,MgCl用Nrul酶對引物Nrul-SNP擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型。酶切反應(yīng)體系為16.0μl:含PCR產(chǎn)物5.0μl,Nrul(10U/μl)0.5μl,10×Tbuffer1.0μl,滅菌蒸餾水9.5μl,37℃反應(yīng)4h。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物,EB染色,培清JS-780全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照分析。1.2.5prrsv易感率測定參照Ait-Ali等1.2.6數(shù)據(jù)分析不同豬種群體不同基因型的PRRSV易感性數(shù)據(jù)分別用SPSS17.0軟件的OneWayANOVA進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。2結(jié)果與分析2.1bec3f基因檢測對豬APOBEC3F基因內(nèi)含子3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1000~2000bp間出現(xiàn)1條特異性條帶(圖1)與預(yù)期結(jié)果一致。對豬APOBEC3F基因外顯子8進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1000~2000bp間出現(xiàn)1條特異性條帶(圖2)與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果顯示,在內(nèi)含子3的16bp處出現(xiàn)1個A/G突變(圖3)。在外顯子8的5bp處出現(xiàn)1個G/A突變(圖4)。經(jīng)分析外顯子8的5bp處出現(xiàn)G/A突變處于Nrul酶切位點內(nèi),而內(nèi)含子3的16bp處A/G突變引物不易設(shè)計,即使用人為創(chuàng)造酶切位點的方法也不能找到合適的限制性內(nèi)切酶。2.2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)針對外顯子8的5bp處G/A的單堿基突變設(shè)計特異性引物,命名為Nrul-SNP。對豬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在500bp與750bp之間得到1條特異性條帶(圖5),與預(yù)期結(jié)果一致。用限制性內(nèi)切酶Nrul對引物Nrul-SNP擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型,以PCR產(chǎn)物作為對照電泳,AA型為1個572bp片段;GG型為379bp和193bp2個片段;GA型為572bp、379bp和193bp3個片段(圖6)。2.3基因特征的apobec3f2.3.1豬群體中基因型的檢測在各豬種群體中外顯子8的5bp處可以檢測到3種基因型,以GG型居多,GA型次之,AA最少;定遠(yuǎn)豬和梅山豬群體中檢測到3種基因型;二花臉豬群體中檢測到GG和GA2種基因型;其他豬群體只檢測到GG1種基因型。在所有被檢測豬種群體中,G等位基因的頻率均高于A等位基因,因此G為優(yōu)勢等位基因(表2)。2.3.2定遠(yuǎn)豬、植物和二花臉豬群體的選擇潛力外顯子8的5bp處在定遠(yuǎn)豬、梅山豬和二花臉豬群體中為中度多態(tài)(0.25<PIC<0.50),而在其他群體中未表現(xiàn)出多態(tài)性,表明該多態(tài)位點在定遠(yuǎn)豬、梅山豬和二花臉豬群體中存在較強(qiáng)的選擇潛力(表2)。采用χ2.4prrsv考數(shù)比較APOBEC3F基因外顯子8的5bp處不同基因型豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)接毒后PRRSV拷貝數(shù)(表3)發(fā)現(xiàn),AA基因型豬PAM細(xì)胞接毒后12hPRRSV拷貝數(shù)顯著高于GG型(P<0.05),極顯著高于GA基因型(P<0.01)。3pam細(xì)胞接毒前后prrsv的易感性大量研究結(jié)果表明APOBEC3F基因具有抑制HIV比較外顯子8的5bp處不同基因型豬PAM細(xì)胞接毒后PRRSV拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn),AA型豬PAM細(xì)胞接毒后12hPRRSV拷貝數(shù)顯著高于GG基因型(P<0.05),極顯著高于GA基因型。表明AA型豬PRRSV易感性高于GG型和GA型,提示G等位基因更有利于抵抗PRRSV的感染。通過數(shù)據(jù)庫查詢對比可以得出,本研究檢測到外顯子8的5bp處G/A突變是有義突變,導(dǎo)致APOBEC3F基因所編碼蛋白質(zhì)的第391位的丙氨酸(Ala)變成蘇氨酸(Thr)。有研究結(jié)果1.2.