薄層層析操作要點

薄層層析操作要點鋪板較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，飽和。嘗試刮邊點樣盡量用小的點樣管。假設有足夠的耐性，最好只用1微升的點樣管。這樣，點的斑點較小，開放的色里晾干。點樣是造成TLC定量誤差的主要來源。試驗證明：定量毛細管更適合較小體積的點樣；微量注射器更適合較大體積的點樣。這主要是由于微量注射器受小氣泡、溶液回爬現(xiàn)象的影響較大。為避開不同定量毛細管間的點樣誤差、建議一塊薄層板上最好用同一只定量毛細管。但應留意更換樣品時，應將毛細管用超聲波或不同極性溶劑清洗干凈。在制備樣品時，溶樣溶劑黏度不能過高，以便于點樣；溶劑沸點過低則進樣體積易變，過高則會轉變開放劑組成；對樣TLC3mm1-2cm1.5cm；HPLC1mm5mm1cm。開放劑配制1ml1ml合計量認證要求，盡管多數(shù)時候這不是必需的。開放系統(tǒng)的飽和板與蒸氣的吸附平衡影響不大，固然動作應當盡量輕、快。溫濕度的掌握〔容量因子〕的變化，濕酸。開放劑的選擇TLC與HPLC相比，一個突出的優(yōu)點就是流淌相的選擇具有更大的敏捷性。流淌相的選擇的目的是使絕大局部樣品的RF值位于0.1--0.7之間并到達較好的分別，與此對應的是流淌相要有適當?shù)膹姸群徒M成。流淌相強度越大，溶質(zhì)RF值越大，但很可能降低分別力量；另外單一溶劑很難分別較簡單的混合物，依據(jù)相像相溶原理，要使用多元溶劑體系。一般開放劑體系選擇如下：依據(jù)分別樣品性質(zhì)、薄層色譜板性質(zhì)選擇一個二元溶劑體系，通過調(diào)整溶劑比例以尋求適合RF值，適合的RF值找到后，再尋求極性參數(shù)一樣的二元溶劑體系兩個，以這三個組成為三點組成一個三角形，則可看到：三角形頂點是二元體系，邊是三元體系，三角形內(nèi)是四元體系，并且極性全都，可依據(jù)幾何原理得出任一點組成。這種方法較為直觀，也較簡潔。顯色噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。TLC抱負的顯色期望靈敏度高、斑點顏色穩(wěn)定、斑點與背景間的比照度好、斑點的大小及顏色的深度與物質(zhì)的量成正比。在樣品組成并不完全的狀況下，通用顯色方法顯得成尤為重要。通用顯色法主要有：紫外照耀法：便利，不破壞樣品；碘蒸氣法：通用性強，與紫外法結合靈敏度高于該兩法單獨使用；熒光試劑：制造熒光背景，使原來紫外下無熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯；硫酸溶液：對絕大多數(shù)有機物有效，但有破壞性。薄層層析(thinlayerchromatography)，也叫薄層色譜、薄板色譜或薄板層析，屬層析技術中的一類，常用TLC代表。如同柱層析一樣，按其作用機理可分為吸附薄層層析，安排薄層層析等。其中應用最廣泛的是吸附薄層層析。其原理見第97～100頁和第102～104頁。薄層層析具有微量、快速、操作簡便等優(yōu)點，但不適合于較大量的樣品的分別，通常可分別的量在0.5g以下，最低可達10 －９g。以下介紹吸附薄層層析的相關問題，其他類型薄層層析可參照處理。薄層層析的用途在試驗室中，薄層層析主要用于以下幾種目的。作為柱層析的先導。一般說來，使用某種固定相和流淌相可以在柱中分別開的混合物，使用同種固定相和流淌相也可以在薄層板上分別開。所以常利用薄層層析為柱層析選擇吸附劑和淋洗劑。監(jiān)控反響進程。在反響過程中定時取樣，將原料和反響混合物分別點在同一塊薄層板上，開放后觀看樣點的相對濃度變化。假設只有原料點，則說明反響沒有進展；假設原料點很快變淡，產(chǎn)物點很快變濃，則說明反響在快速進展；假設原料點根本消逝，產(chǎn)物點變得很濃，則說明反響根本完成。檢測其他分別純化過程。在柱層析、結晶、萃取等分別純化過程中，將分別出來的組分或純化所得的產(chǎn)物溶樣點板，開放后假設只有一個點，則說明已經(jīng)完全分別開了或已經(jīng)純化好了；假設開放后仍有兩個或多個斑點，則說明分別純化尚未到達預期的效果。確定混合物中的組分數(shù)目。一般說來，混合物溶液點樣開放后消滅幾個斑點，就說明混合物中有幾個組分。確定兩個或多個樣品是否為同一物質(zhì)。將各樣品點在同一塊薄層板上，開放后假設各樣點爬升的高度一樣，則大體上可以認定為同一物質(zhì)，假設上上升度不同，則確定不是同一物質(zhì)。依據(jù)薄層板上各組分斑點的相對濃度可粗略地推斷各組分的相對含量。快速分別出少量純潔樣品。為了盡快從反響混合物中分別出少量純潔樣品作分析測試，可擴大薄層板的面積，加大薄層的厚度，并將混合物樣液點成一條線，一次可分別出數(shù)十毫克到五百毫克的樣品。薄層層析的儀器和藥品薄板薄層層析所用的基板通常為玻璃板，也有用塑料板的，依據(jù)用途的不同而有不同的規(guī)格。作分析鑒定用的多為7.5cm×2.5cm20cm×15cm的大小，將棱角用砂紙稍加打磨，以免割破手指，然后洗凈枯燥即可使用。近年來，有些廠商將吸附劑涂在大張金屬箔片上出售。購回后只需用剪刀剪成適宜大小即可點樣開放。用完后可以適當溶劑將箔片上樣點浸萃掉，經(jīng)枯燥后即可重復使用，但吸附劑涂層很薄，一般只可作分析鑒定用。開放槽開放槽也叫層析缸，規(guī)格形式不一。圖3-39abcd靠式，efa,b,c,d,f3-39薄層板在不同的層析缸中開放吸附劑薄層層析中所用吸附劑最常見的有硅膠和氧化鋁兩類。其中不加任何添加劑的以H表示，如硅膠H，氧H；加有煅石膏(CaSO４·1/2H２O)為粘合劑的用G(gypsum)，如硅膠G，氧化鋁G；加有熒光素的用F(fluorescein)，如硅膠HF２５４，意思是其中所加熒光素可在波長254nmGFGF２５４，氧化鋁GF２５４。如在制板時以羧甲基纖維素鈉的溶液調(diào)和，則用CMC示(carboxymethylcelluloseCMC。添加粘合劑是為了加強薄層板的機械強度，其中以添加CMC最高；添加熒光素是為了顯色的便利。習慣上把加有粘合劑的薄層板稱為硬板，不加粘合劑的薄層板稱為軟板。供薄層層析用的吸附劑粒度較小200SilicagelHforthinlayerchromatography,使用時應予留意，不行用柱層析吸附劑代替，也不行混用。薄層層析用的氧化鋁也有酸性、中性、堿性之分，也分五個活性等級。選擇原則與柱層析類同。開放劑在薄層層析中用作流淌相的溶劑稱為開放劑，它相當于柱層析中的淋洗劑，其選擇原則也與淋洗劑類同，也是由被分別物質(zhì)的極性打算的，被分別物極性小，選用極性較小的開放劑；被分別物極性大，選用極性較大的開放劑。環(huán)己烷和石油醚是最常使用的非極性開放劑，適合于非極性或弱極性試樣；乙酸乙酯、丙酮或甲醇適合于分別極性較強的試樣，氯仿和苯是中等極性的開放劑，可用作多官能團化合物的分別和鑒定。假設單一開放劑不能很好分別，也可承受不同比例的混合溶劑開放。選擇開放劑的一條快捷的途徑是在同一塊薄層板上點上被分別樣品的幾個樣點，各樣點間至少相距1cm，再用滴管分別吸取不同的溶劑，各自點在一個樣點上，溶劑將從樣點向外擴展，形成一些同心的圓環(huán)。假設樣點根本上不隨溶劑移動(見圖3-40a)，或始終隨溶劑移動到前沿(見圖3-40d)，則這樣的溶劑不適用。假設樣點隨溶劑移動適當距離，形成3-40b3-40c)，則該溶劑一般可作為開放劑使用。圖3-40選擇開放劑 圖3-41載玻片浸漬涂層薄層層析的操作制板制板也稱鋪板或鋪層，有“干法”和“濕法”兩種，由于枯燥的吸附劑在玻璃板上附著力差，簡潔脫落，不便操作，所以很少承受，此處只介紹濕法鋪板。供分析、鑒定、監(jiān)控用的載玻片的鋪制。首先將吸附劑用溶劑調(diào)成糊狀，所用溶劑可以是低沸點有機溶劑，也可以是蒸餾水。有機溶劑中應用較廣的是氯仿，一般依據(jù)每克硅膠3mL氯仿的比例在廣口瓶中調(diào)成糊狀，馬上以帶螺旋的蓋子蓋緊備用。在鋪板時用力搖勻，旋開蓋子，將兩塊載玻片疊在一起，以食指和拇指捏住它們的側面靠近一端處，緩慢平穩(wěn)地浸入瓶中的糊狀吸附劑里，使糊狀物浸沒至離載玻片頂端約1cm處，然后緩緩提起(見圖3-41)，在空氣中握持片刻，使氯仿大局部揮發(fā)掉。將兩塊載玻片拆開，浸涂面對上，平放在桌上，枯燥后即可使用。每次浸涂后應立馬上廣口瓶蓋嚴密封，以免溶劑揮發(fā)。這樣制得的薄層板機械性能稍差。為了提高薄層強度，可用甲醇代替氯仿，或將甲醇與氯仿按不同的比例混合使用。G2～3mL蒸餾水(或3～4mL1～2mL蒸餾水的比例參加溶劑，馬上研磨成糊狀。用牛角匙舀取糊狀物倒在載玻片上快速攤布均勻，也可小扣載玻片邊緣，或將載玻片托在手中前后左右稍稍傾斜，靠糊狀物的流動性使之分布均勻。然后再平放在臺面上，使其固化定型并晾干。固化的過程是吸附劑內(nèi)的煅石膏吸取水形成固體的過程，反響式為：CaSO4·1/2H2O+3/2H2O＝CaSO4·2H2O所以研磨糊狀物和涂鋪薄層板都需盡可能的快速。假設動作稍慢，糊狀物即會結成團塊狀無法涂鋪或不能涂鋪均勻，即使再加水也不能再調(diào)成均勻的糊狀。通常研磨糊狀物需在1min左右完成，鋪完全部載玻片也只需數(shù)分鐘，最多在十數(shù)分鐘內(nèi)完成。每次鋪板都需臨時研磨糊狀物。以蒸餾水作溶劑制得的薄層板具有較好的機械性能，如欲獲得機械性11g100mL充分溶解，然后用砂芯漏斗過濾。用所得濾液如前述方法調(diào)糊鋪板，這樣的薄層板具有足夠的機械性能，可以用鉛筆纖維素碳化而使薄層變黑。圖3-42 薄層涂布器1—鋪好的薄層板；2—涂布器；3，5—厚玻板；4—玻璃板涂布器制板法。圖3-42為薄層涂布器。將幾塊玻璃板放在涂布器中間擺好，兩邊是兩塊比前者約厚0.5mm的玻璃板，向涂布器槽中倒入預先調(diào)好的糊狀吸附劑，將涂布器自左向右推去即能將糊狀物均勻地涂在玻璃板上。待晾干定型之后，將幾塊玻璃板分開，刮去邊上多余的吸附劑即得到肯定厚度的薄層層析板。較大薄層板的鋪制。供分別純化用的薄層板具有較大的尺寸，通常都是用蒸餾水來調(diào)制糊狀物的，方法同前。鋪板的方法如下：傾注法將玻璃板平放在臺面上，把研好的糊狀物快速傾倒在玻璃板上，用干凈玻璃棒攤平，或手托玻璃板微微傾斜，并輕小扣擊玻璃板反面，使之流淌，即可獲得平坦均勻的薄層。1mm的玻璃板條。將調(diào)好的糊狀物倒在中間的玻板上，用一根有機玻璃尺將糊狀物沿一個方向刮平，即形成厚1mm的均勻薄層。待固化定型后抽去兩邊的玻璃板條即可。大薄層板的活化及存放方法與載玻片一樣。不管以何種方法鋪板，都要求鋪得的薄層厚薄均一，沒有紋路，沒有團塊凸起。紋路或團塊的產(chǎn)生緣由是糊狀物調(diào)得不均勻，或鋪制太慢，或在局部固化的板子上又參加的糊狀物，所以為獲得均勻的薄層，應動作快速，一次研勻，一次傾倒，一次鋪成?；罨瘜⒘栏珊蟮谋“逡迫牒嫦鋬?nèi)“活化”?；罨臏囟纫蛭絼┎煌煌?。硅膠薄板在105～110℃烘焙0.5～1h即可；200～220℃烘焙4h150～160℃烘焙4h，活性相當于Ⅲ～Ⅳ級。活化后的薄層板就在烘箱內(nèi)自然冷卻至接近室溫，取出后馬上放入枯燥器內(nèi)備用。(3)點樣固體樣品通常溶解在適宜的溶劑中配成1%～5%的溶液，用內(nèi)徑小于1mm的平口毛細管吸取樣品溶液點樣。點樣前可用鉛筆在距薄層板一端約1cm處輕輕地畫一條水平橫線作為“起始線”。然后將樣品溶液留神地點在“起始線”上。樣品斑點的直徑一般不應超過2mm。假設樣品溶液太稀需要重復點樣時，須待前一次點樣的溶劑揮發(fā)之后再點樣。點樣時毛細管的下端應輕輕接觸吸附劑層。如果用力過猛，會將吸附劑層戳成一個孔，影響吸附劑層的毛細作用，從而影響樣品的Ｒｆ值。假設在同一塊板上點兩個以上樣點時，樣點之間的距離不應小于1cm。點樣后待樣點上溶劑揮發(fā)干凈才能放入開放槽中開放。開放開放劑帶動樣點在薄層板上移動的過程叫開放。開放過程是在布滿開放劑蒸氣的密閉的開放槽中進展的。開放的方式有直立式、臥式、斜靠式、下行式、雙向式等。直立式開放是在立式開放槽中進展的，如圖3-39a0.5cm的開放劑，蓋上蓋子放置片刻，(留意開放劑不行浸及樣點)，蓋好蓋子。由于吸附劑的毛細作用，開放劑緩緩向上爬升。假設開放劑選得適宜，樣點也隨之開放。當開放劑前沿升至距薄層板上端約1cm假設樣品中各組分的比移值都較小，則應當換用極性大一些的開放劑；反之，假設各組分的比移值都較大，則應換用極性小一些的開放劑。每次更換溶劑，必需等開放槽中前一次的溶劑揮發(fā)干凈后，再參加的溶劑。更換溶劑后，必須更換薄層板并重點樣、開放，重復整個操作過程。直立式開放只適合于硬板。臥式開放如圖3-39b所示，薄層板傾斜15°放置，點樣端向下，涂層向上，操作方法同直立式，只是開放槽中所放的開放劑應更淺一些。臥式開放既適用于硬板，也適用于軟板。3-39c，d，f30°～90°之間，一般也只適合于硬板。3-39e所示。薄層板豎直懸掛在開放槽中，一根濾紙條或紗布條搭在開放劑和層析板上沿，靠毛90°再換一種開放劑向另一方向開放。此法適合于成分簡單或較難分別的混合物樣品。3-39f所示，開放后成為帶狀，用不銹鋼鏟將各色帶刮下分別萃取，各自蒸去溶劑，即可得到各組分的純品。假設無開放槽，可用帶有螺旋蓋的廣口瓶代替，如圖3-39c所示。假設開放槽較大，則應預先在其中放入濾紙襯里，如3-39c,d,f所示。襯里的作用是使開放劑沿襯里上升并揮發(fā)，使開放劑蒸氣快速布滿開放槽。顯色分別和鑒定無色物質(zhì)，必需先經(jīng)過顯色，才能觀看到斑點的位置，推斷分別狀況。常用的顯色方法有如下幾種：①碘蒸氣顯色法。由于碘能與很多有機化合物(烷烴和氯代烴除外)(溶劑已揮發(fā)干凈)放入其中并密閉起來，(由于碘易揮發(fā)，斑點的棕色在空氣中很快就會消逝)，計算Rf值。②紫外光顯色法。假設被分別(或分析)樣品并無熒光性，可以選用加有熒光劑的吸附劑