銅鋅超氧化物歧化酶在氧自由基平衡中的作用

銅鋅超氧化物歧化酶在氧自由基平衡中的作用

sod是一種廣泛存在于生物中的金屬酶。根據(jù)金屬化合物的不同，它主要分為cuzn-sod、mnsod、fe-sod和ni-sod。已有研究表明,在生物體內(nèi)存在著兩種類型的銅鋅超氧化物歧化酶:一種是細(xì)胞內(nèi)形式,叫細(xì)胞內(nèi)銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD);另一種是細(xì)胞外形式,稱之為細(xì)胞外銅鋅超氧化物歧化酶(EC-SOD),二者在催化歧化反應(yīng)時有著相同的速率和相似的動力學(xué)常數(shù)。本文對這兩種酶在生物體內(nèi)的分布、蛋白結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能等方面進(jìn)行了綜述。1cuzn-sod的制備從SOD的定向進(jìn)化角度來說,CuZn-SOD是真核生物酶,主要存在于真核生物的細(xì)胞質(zhì)、植物葉綠體的基質(zhì)和過氧化物酶體中。但研究發(fā)現(xiàn),在某些原核生物中,也存在有CuZn-SOD。EC-SOD是1982年Marklund等首先在動物血漿中發(fā)現(xiàn)的,在人體中主要分布在組織外基質(zhì)和細(xì)胞表面上,是細(xì)胞外液如血漿、淋巴液、關(guān)節(jié)液及腦脊液中最主要的SOD同工酶,也是清除細(xì)胞外O2結(jié)構(gòu)2.1x-射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析cuzn-sod的結(jié)構(gòu)一般由兩個相同亞基構(gòu)成,每個亞基含一個Cu原子和一個Zn原子。CuZnSOD結(jié)構(gòu)上的同源性表現(xiàn)為:與金屬輔基相連的氨基酸殘基和參與肽鏈內(nèi)部二硫鍵形成部位附近的氨基酸殘基相同;富含甘氨酸殘基,它們的大量存在和均勻分布有利于形成酶分子的高級結(jié)構(gòu);氨基酸序列中都有一個位于分子結(jié)構(gòu)表面的超可變區(qū),可能與免疫學(xué)性質(zhì)有關(guān);羧基末端有一序列同源性很高的區(qū)域,在此區(qū)域有一個精氨酸(Arg141),對酶活力的維持起關(guān)鍵作用。CuZn-SOD高級結(jié)構(gòu)的信息來源于X-射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析。以牛紅細(xì)胞CuZn-SOD為例,該酶由兩個結(jié)構(gòu)相同的亞基構(gòu)成,亞基結(jié)構(gòu)核心是一個由八股反平行的β折疊和3個無代表性結(jié)構(gòu)的環(huán)組成的具有拓?fù)湫缘耐?β桶),整個結(jié)構(gòu)含α-螺旋較少。兩個亞基之間通過非共價鍵的疏水作用結(jié)合,兩個Cu原子之間相距3.38nm,同一亞基中Cu、Zn相距0.63nm。CuZn-SOD的活性部分是一個橢圓形的口袋,Cu、Zn與6個組氨酸(His)殘基和1個天冬氨酸(Asp)形成狹長的袋底,其中Cu原子分別與His44、His46、His61、His118配位,Zn則與His61、His69、His78和Asp81配位,Cu、Zn共同連接His61組成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。Cu靠近溶劑面,β桶邊緣的Arg141有輔助引導(dǎo)底物向Cu離子靠近的作用;Zn則包埋于疏水基團(tuán)中,起穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用。半胱氨酸Cys55和Cys144-SH基之間形成的二硫鍵是CuZn-SOD中唯一的一對鏈內(nèi)二硫鍵,對維持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定也起著重要作用。2.2ec-sod及trp1ile95這是一種分泌型糖蛋白,一般由4個相同亞基組成,每個亞基含有一個Cu原子和一個Zn原子,雙亞基間通過半胱氨酸的二硫鍵連接。人EC-SOD的cDNA編碼30kD大小的亞基,它是由240個氨基酸殘基組成的多肽,包括18個氨基酸組成的信號肽和222個氨基酸組成的成熟蛋白。EC-SOD主要由3個功能結(jié)構(gòu)域組成:N-端序列(Trp1~Ile95),在Asn89處有一糖基化位點,主要有助于酶的溶解;活性中心區(qū)域(His96~Gly193),與CuZn-SOD后2/3部分有高度同源性;C-端結(jié)構(gòu)域(Val194~Ala222),其中包含有9個氨基酸殘基組成的帶正電荷的區(qū)域。2.2.1ec-sod-四聚體EC-SOD的N-末端存在一段α-螺旋結(jié)構(gòu),進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),在Ala14~Met32之間形成了一段兩性的α-螺旋,這一結(jié)構(gòu)的主要作用是介導(dǎo)形成EC-SOD四聚體。在小鼠EC-SOD中,由于Asp24改變?yōu)閂al24,使其形成二聚體而不是通常的四聚體,由此證明,EC-SOD的N-末端主要是依賴這一段α-螺旋的相互作用而形成四聚體的。Edlund等將Asn89變?yōu)镚ln以去除糖基化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有糖基的EC-SOD其溶解度大幅下降。2.2.2半胱氨酸衍生物及其他類化合物EC-SOD和CuZn-SOD的活性中心的同源性達(dá)50%,兩者有許多相同的特點:都有著相同的金屬輔基,以及相同的與催化活性相關(guān)的必需氨基酸;在CuZn-SOD中起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用的半胱氨酸也存在于EC-SOD中;有相同的抑制劑如氰化物、疊氮化合物等;兩者都可以耐受極端pH、高溫以及強(qiáng)變性劑如尿素、鹽酸胍。在活性中心中,Zn存在于蛋白內(nèi)部,不參與活性反應(yīng);Cu則在反應(yīng)中起重要作用。2.2.3ec-sod的純化在C-末端的26個氨基酸中含有6個Arg和3個Lys及其他親水性氨基酸,因此這一部分是暴露在溶劑中的。二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析均表明這部分也是α-螺旋。C-末端主要表現(xiàn)為對肝素和Ⅰ型膠原蛋白的親和力,使EC-SOD可以結(jié)合于細(xì)胞間質(zhì)上。由于含有較多的Arg和Lys,所以C-末端較易被水解。早在1987年,Tibell等對EC-SOD進(jìn)行SDS分析時就發(fā)現(xiàn),在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)了兩條著色帶,但最初人們認(rèn)為是在純化時被蛋白酶水解所致的,后來隨著研究的深入才逐漸發(fā)現(xiàn)EC-SOD在組織內(nèi)就已經(jīng)被水解,甚至是在細(xì)胞內(nèi)剛被合成時就立即被水解了。2002年,研究人員發(fā)現(xiàn)EC-SOD也存在于細(xì)胞內(nèi),研究表明這一過程是由C-端介導(dǎo)的,因此C-末端具有核轉(zhuǎn)位信號的作用。2.2.4硫鍵的結(jié)合方式EC-SOD的一級結(jié)構(gòu)中有6個Cys(Cys45、Cys107、Cys189、Cys190、Cys195和Cys219),分析發(fā)現(xiàn),EC-SOD中存在兩種不同的二硫鍵結(jié)合方式:一種有活性(aEC-SOD),形成Cys45-Cys190和Cys107-Cys189兩個二硫鍵,Cys195不參與二硫鍵形成;一種沒有活性(iEC-SOD),形成Cys107-Cys195和Cys189-Cys190兩個二硫鍵,Cys45不參與二硫鍵形成。推測iEC-SOD沒有活性的主要原因是由于沒有形成和CuZn-SOD相同的二硫鍵結(jié)合方式(Cys107-Cys189)。在CuZn-SOD中,這個二硫鍵的主要作用是穩(wěn)定活性中心。3ec-sod與認(rèn)知能力SOD是機(jī)體活性氧清除反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶,對防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用。作為生物體細(xì)胞中最主要的抗氧化酶,SOD是通過催化下列反應(yīng):O3.1EC-SOD在體內(nèi)有著重要的生理作用和生物學(xué)功能,研究表明,EC-SOD主要在NO信號傳導(dǎo)、心腦血管疾病、糖尿病及抗衰老方面發(fā)揮著重要作用。自由基在體內(nèi)的積累會引起蛋白質(zhì)氧化,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,酶功能喪失等機(jī)體損傷。EC-SOD可以清除體內(nèi)多余的O3.2氧化應(yīng)激在許多神經(jīng)性疾病如老年癡呆癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和帕金森綜合癥中起著重要作用。因此,抗氧化劑在預(yù)防和治療這類疾病的過程中被認(rèn)為具有重要作用。最近的研究表明,大腦中EC-SOD的表達(dá)量和調(diào)控與認(rèn)知能力有密切聯(lián)系。野生型小鼠與EC-SOD過表達(dá)小鼠相比,其學(xué)習(xí)和記憶能力隨著年齡的增長有不同程度的削弱,在對其進(jìn)行走迷宮實驗時可以清楚地發(fā)現(xiàn)兩者年輕時沒有明顯的區(qū)別,但是到了老年則有了明顯差別,EC-SOD過表達(dá)組的學(xué)習(xí)和記憶能力明顯優(yōu)于野生型。而對EC-SOD轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗則發(fā)現(xiàn),過量的EC-SOD會減弱其形成某些長期記憶的能力。因此必須調(diào)節(jié)EC-SOD的生理濃度以維持機(jī)體功能正常。3.3隨著對嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染等疾病的搶救技術(shù)水平的提高,肺部疾病患者不直接死于原發(fā)性疾病,而是死于繼發(fā)性急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。有研究表明,肺組織中嗜中性粒細(xì)胞分泌出的活性氧自由基(ROS)在引發(fā)ARDS中起到了關(guān)鍵作用。向動物模型中注入SOD可以有效保護(hù)肺組織,減少傷害。在對EC-SOD轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn),EC-SOD的過表達(dá)可以有效地減少肺組織在高氧高壓誘導(dǎo)中的損傷,且EC-SOD可以減少肺損傷中嗜中性粒細(xì)胞的堆積,從而減輕肺部急性炎癥。最近一項研究表明,人體關(guān)節(jié)中含有大量的EC-SOD,它們結(jié)合在關(guān)節(jié)軟骨中的Ⅰ型膠原蛋白上,并且可以有效地清除ROS保護(hù)膠原蛋白。可以設(shè)想,在不久的將來EC-SOD可能會成為預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的有效藥物。3.4現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證明,人類的衰老與人體內(nèi)ROS的生成密切相關(guān)。有實驗指出,胎兒未出生時體內(nèi)就含有大量EC-SOD,以備出生時接觸高氧環(huán)境,新生兒一歲后體內(nèi)EC-SOD含量達(dá)到最高;而在后來的20年內(nèi)EC-SOD含量則以每年2%的速度下降。隨著時間的推移,體內(nèi)抗氧化酶的含量越來越少,ROS的產(chǎn)生卻越來越多,隨之對機(jī)體各器官的損害也會越來越大。當(dāng)ROS對機(jī)體的損傷積累到一定程度就會引起機(jī)體疾病的發(fā)生。有研究顯示,生物體內(nèi)SOD含量與ROS的積累呈負(fù)相關(guān)。可以認(rèn)為,在體內(nèi)專一清除ROS的SOD可以有效減慢衰老,提高人類的生活質(zhì)量。4cuzn-sod的模擬研究CuZn-SOD是一種療效廣泛的藥用酶,但天然酶分子量大且難透過細(xì)胞膜,穩(wěn)定性較差,體內(nèi)半衰期短,且具有免疫原性,功能相對單一,從而限制了其應(yīng)用。為了改變這種情況,近些年來國內(nèi)外學(xué)者在CuZnSOD的化學(xué)修飾、酶的模擬等方面進(jìn)行了大量研究。經(jīng)化學(xué)修飾后的CuZn-SOD,其耐熱、耐酸堿、抗蛋白酶水解的能力均有顯著提高。Cu