實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物-斑馬魚課件

1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物—斑馬魚生藥學(xué)張彩UseZebrafishASAModelOrganism1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物—斑馬魚生藥學(xué)張彩UseZebrafi2匯報(bào)內(nèi)容斑馬魚概況斑馬魚作為模式生物的優(yōu)點(diǎn)斑馬魚在藥物的評(píng)價(jià)中的應(yīng)用采用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)三種中藥成分的急性毒性2匯報(bào)內(nèi)容斑馬魚概況3概況70年代早期，斑馬魚僅在一個(gè)研究中心被詳細(xì)研究：在位于Eugene的俄勒岡大學(xué)，CharlesKimmel及其同事開始將斑馬魚作為研究發(fā)育的動(dòng)物模型，并探索其作用。第一部分ChuckKimmel3概況70年代早期，斑馬魚僅在一個(gè)研究中心被詳細(xì)研究：在4斑馬魚作為模式動(dòng)物逐漸受到關(guān)注

TurnEyestoFishChristianeNüsslein-Volhard

1995

諾貝爾獎(jiǎng)獲得者wasabletoidentifyandclassifyasmallnumberofgenesthatareofkeyimportanceindeterminingthebodyplanandtheformationofbodysegments,turnedeyestofishandfindawiderangeofmutationsWolfgangDriever4斑馬魚作為模式動(dòng)物逐漸受到關(guān)注

TurnEyesto5斑馬魚基本特性產(chǎn)于熱帶印度，孟加拉國。成魚體長4～6厘米。體呈紡錘形。雌雄易區(qū)分。性情溫和，對(duì)水溫水質(zhì)要求不高，易飼養(yǎng)。屬卵生魚類，4月齡進(jìn)入性成熟期。繁殖期約7天左右。產(chǎn)卵量高，繁殖力很強(qiáng)。體外受精，胚胎透明，在24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形，2~3天孵出仔魚。5斑馬魚基本特性產(chǎn)于熱帶印度，孟加拉國。6♀♂斑馬魚的繁殖6♀♂斑馬魚的繁殖7斑馬魚胚胎早期發(fā)育圖譜7斑馬魚胚胎早期發(fā)育圖譜8斑馬魚作為模式生物的優(yōu)點(diǎn)1.斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，這意味著在其身上做藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體，因此它受到生物學(xué)家的重視。2.斑馬魚的胚胎是透明的，所以生物學(xué)家很容易觀察到藥物對(duì)其體內(nèi)器官的影響。3.此外，雌性斑馬魚可產(chǎn)卵數(shù)百枚，胚胎在24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形，這使得生物學(xué)家可以在同一代魚身上進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而研究病理演化過程并找到病因。8斑馬魚作為模式生物的優(yōu)點(diǎn)1.斑馬魚基因與人類基因的相似度9心血管系統(tǒng)發(fā)育

DevelopmentofZebrafishVascularSystemNatureMedicine,19959心血管系統(tǒng)發(fā)育

DevelopmentofZebraf10DevelopmentofZebrafishVascularSystem28hours

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10DevelopmentofZebrafishVa11斑馬魚的骨骼發(fā)育缺少chordin表達(dá)的斑馬魚的BMP蛋白水平異常，鰭和尾部骨架也異?！⑸鋍hordinmRNA后可恢復(fù)。因此研究者使用斑馬魚的這項(xiàng)特性來進(jìn)行基因篩查，以確定脊椎動(dòng)物骨骼形成的調(diào)節(jié)機(jī)制。

—RikDerynckNatureGenetics,199911斑馬魚的骨骼發(fā)育缺少chordin表達(dá)的斑馬魚的BMP蛋12斑馬魚的心臟再生

HeartRegenerationinZebrafish斑馬魚的Mps1mitoticcheckpointkinase是一個(gè)至關(guān)重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，如發(fā)生突變，則斑馬魚的心臟不能被修復(fù)而形成疤痕。因此，損傷誘導(dǎo)的斑馬魚心肌細(xì)胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明斑馬魚在分析心臟再生的分子機(jī)制方面起重要作用。12斑馬魚的心臟再生

HeartRegeneration1313DECEMBER2002VOL298SCIENCE

心臟切除后心室肌的再生

Regenerationofventricularmyocardiumintheresectedzebrafishheart1313DECEMBER2002VOL298SCI14斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用1.一般毒性評(píng)價(jià)2.發(fā)育毒性評(píng)價(jià)3.心血管毒性評(píng)價(jià)4.肝臟毒性評(píng)價(jià)5.神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)6.腎毒性評(píng)價(jià)7.腸胃毒性評(píng)價(jià)8.視覺毒性評(píng)價(jià)9.耳毒性評(píng)價(jià)10.軟骨毒性評(píng)價(jià)14斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用1.一般毒性評(píng)價(jià)15斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用1.一般毒性評(píng)價(jià)：在化合物的一般毒性評(píng)價(jià)可在胚胎、幼魚、成魚的各個(gè)階段進(jìn)行,相應(yīng)的觀察指標(biāo)略有不同。在胚胎期,在化合物的作用下可觀察終點(diǎn)有卵凝結(jié)、體節(jié)形成、尾部延展、心跳、色素沉著、孵化率、畸形率等。幼魚和成魚主要是統(tǒng)計(jì)LC50、死亡率等。2.發(fā)育毒性評(píng)價(jià)：在胚胎發(fā)育和幼魚發(fā)育過程中,很多器官系統(tǒng)的形成過程對(duì)藥物的介人是相當(dāng)敏感的,比如腦、心血管、肝臟、軟骨、脊索、胰腺、腸道、腎臟,極易導(dǎo)致畸形的產(chǎn)生,是評(píng)價(jià)藥物致畸性的有效模型之一。15斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用1.一般毒性評(píng)價(jià)：在化合物的一般16斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用3.心血管毒性評(píng)價(jià)：心臟是斑馬魚第一個(gè)發(fā)育起來并發(fā)揮作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶點(diǎn)。由于胚胎和幼魚的透明性,無需借助遙測(cè)或其他技術(shù)就可以實(shí)時(shí)觀察心跳、心臟的收縮性、血液循環(huán),非常的便利。4.肝臟毒性評(píng)價(jià)：藥物引起的肝損傷是制藥業(yè)一個(gè)主要的毒理學(xué)問題。目前,應(yīng)用斑馬魚進(jìn)行的肝臟毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)主要有血清酶、肝細(xì)胞凋亡、細(xì)胞色素P450和組織病理學(xué)變化。16斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用3.心血管毒性評(píng)價(jià)：心臟是斑馬魚17斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用5.神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚胚胎在24hpf原代神經(jīng)元細(xì)胞開始分化,48hpf腦室形成,在6dPf所有的神經(jīng)系統(tǒng)形成,斑馬魚可在短時(shí)間呈現(xiàn)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng),可作為一個(gè)有機(jī)載體,建立一個(gè)快速的、有效的評(píng)價(jià)藥物神經(jīng)毒性的平臺(tái)。6.腎毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚的原腎由一對(duì)腎單位、兩個(gè)腎小球和前腎小管組成,較為簡單。慶大霉素可引起哺乳動(dòng)物腎中毒,其表型在斑馬魚原腎上也可看到,既腎小球?yàn)V過率降低。盡管結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度不一樣,但是在腎損傷表型方面卻是保守的。所以以斑馬魚為腎毒性評(píng)價(jià)載體,能為藥物在臨床上的應(yīng)用提供重要的參考價(jià)值。17斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用5.神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚胚胎在218斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用7.胃腸毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚的胃腸系統(tǒng)和人體胃腸系統(tǒng)有著千差萬別,斑馬魚沒有胃,腸道直接開始于咽部下的一小段食道之后。在發(fā)育的早期腸道就開始蠕動(dòng),在未喂食時(shí)就自發(fā)的游走性蠕動(dòng),由于幼魚是透明的,這些蠕動(dòng)清晰可見。8.視覺毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚有著與人類相似的錐形視網(wǎng)膜,有色彩視覺,這點(diǎn)超越了喜好夜間活動(dòng)的嚙齒類模式生物。同時(shí),斑馬魚胚胎期視覺系統(tǒng)發(fā)育迅速,幼魚就展示了視覺介導(dǎo)的行為,故可用于評(píng)價(jià)化合物對(duì)視覺的影響。18斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用7.胃腸毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚的胃腸系19斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用9.耳毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚側(cè)線上的神經(jīng)丘在結(jié)構(gòu)和功能上就相當(dāng)于人內(nèi)耳的毛細(xì)胞。神經(jīng)丘在側(cè)線上從頭至尾排列,胚胎時(shí)期在光鏡下清楚可見,有助于藥物作用下,觀察其形態(tài)和功能變化。10.軟骨毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚的骨頭與人類的相似,顱面骨骼都有膜內(nèi)和軟骨內(nèi)成骨。斑馬魚也有成骨細(xì)胞核和骨細(xì)胞,并布滿血管,受神經(jīng)支配。19斑馬魚在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用9.耳毒性評(píng)價(jià)：斑馬魚側(cè)線上的神20采用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)三種中藥成分的急性毒性

1.主要試劑：雷公藤甲素(triptolide),中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所(江蘇,南京)惠贈(zèng),純度大于98%.大黃素(emodin),瑞雷植化制劑廠提供,含量98%.苦參堿(matrine),江蘇天晟藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,含量98%.DMSO為Sigma公司產(chǎn)品(美國)。超純水取自Millipore超純水機(jī)。20采用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)三種中藥成分的急性毒性

212.方法：實(shí)驗(yàn)前一天禁食。取成體斑馬魚分別置于含有30~50mL溶液的瓶中,保持瓶中溶液溫度恒定在25℃，隨機(jī)分為空白對(duì)照,溶劑對(duì)照及各藥物濃度給藥組,每組含15條。分別給予純凈水,含不同濃度藥物的純凈水。

記錄不同濃度藥液中斑馬魚在24h內(nèi)的死亡數(shù)量(只),計(jì)算死亡率(%)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)